一种葡萄糖脱氢酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种葡萄糖脱氢酶突变体，生产该葡萄 糖脱氢酶突变体的基因工程菌的构建，该葡萄糖脱氢酶突变体的生产及应用。
【背景技术】
[0002] 本发明涉及制备如下式I所示的化合物的方法。
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[0004] 上述的化合物适于在若干药物活性成分的制备中作为中间体，特别是制备 HMG-CoA还原酶抑制剂时，更特别地，制备斯达汀（statin)时，例如制备阿托伐他汀 (Atorvastatin)时。现有技术中对于制备上述结构式I化合物的方法一般包括：
[0005] 例如，Advanced Synthesis&Catalysis, 2008, 350, 1751-59 公开了 6_ 氯代甲 基-四氢吡喃-2, 4-二醇在液溴-水氧化下生成内酯；又如，美国专利US6870059公 开了利用溴的溶液氧化6-氯代甲基-四氢吡喃-2, 4-二醇生成内酯的反应；再如， PNAS，2004, 101,5788-93公开了 6-氯代甲基-四氢吡喃-2, 4-二醇在次氯酸钠和冰醋 酸氧化下生成内酯的反应；再如，国际申请W02006134482中公开了 6-氨基乙基-四氢吡 喃-2, 4-二醇在碳酸钡和液溴作用下生成内酯的反应；再如，国际申请W02009019561中公 开了 6-氨基乙基-四氢吡喃-2, 4-二醇在碳酸钡和液溴作用下生成内酯的反应；又如，国 际申请W02013068917中公开了如下式II所示的化合物在醇脱氢酶作用下生成式I所示的 化合物，如下所示：
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[0007] 但是，上述的方法或者存在反应比较剧烈，后处理难以进行，或者存在对环境不友 好的缺点，或者存在反应试剂价格昂贵等缺点，所以不适合工业化大生产的进行。
[0008] 由于化学法存在着上述的缺点与不足，现在对于生物催化的方法开始进行较多的 研究，比如：国际申请W02013068917公开了（4R，6S)-6-氯代甲基四氢-2H-吡喃-2, 4-二 醇在醇脱氢酶（ADH)作用下生成（4R，6S)-6-氯代甲基-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-酮的方 法。Lek公司在Metabolic Engining上报道了用大肠杆菌来源的批略喹啉醌（PQQ)依赖的 葡萄糖脱氢酶（PQQ-GDH)实现半缩醛到内酯的氧化，但是转化过程中需要补加昂贵的PQQ， 成本较高。
【发明内容】
[0009] 针对现有技术中半缩醛氧化成内酯的反应中反应比较剧烈，后处理难以进行，或 者对环境不友好，或者反应试剂价格昂贵，添加了价格较为昂贵的辅酶，不适合工业化大生 产等缺点，本发明提供一种催化活性高、反应收率高，对环境友好的葡萄糖脱氢酶进行氧化 合成6-取代四氢吡喃-2-酮衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶-化学合成方 法。还提供了该葡萄糖脱氢酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及，该 葡萄糖脱氢酶的高效制备方法，以及该葡萄糖脱氢酶在催化半缩醛氧化成内酯中的用途。
[0010] 本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：
[0011] 本发明的第一方面提供了一种分离的葡萄糖脱氢酶，其是如下（a)、（b)或（c)的 蛋白质：
[0012] (a)由SEQ ID No: 1所示氨基酸序列组成的蛋白质。
[0013] SEQ ID No: 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有氧化脱氢的功 能，是一种新的葡萄糖脱氢酶。
[0014] (b)在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的 具有氧化脱氢活性的蛋白质。
[0015] 其中，所述的"几个"是指2个至小于100个，更佳的小于30个。比如添加一个 外分泌信号肽的融合蛋白，本发明发现这样的融合蛋白同样具有氧化脱氢酶活性。也就是 说，只要由（a)衍生的蛋白质具有氧化脱氢酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发 明的发明目的。根据本发明，在如SEQ ID N〇:l所示氨基酸序列的蛋白质（a)分子中进行 1~30个氨基酸残基的突变，仍然保持氧化脱氢酶活性。
[0016] (c)和（a)的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性且具有氧化 脱氢活性的蛋白质。
[0017] SEQ ID No: 1所示的葡萄糖脱氢酶和已知的葡萄糖脱氢酶，如大肠杆菌来源的PQQ 依赖的⑶Η之间的同一性为76 %，具有显著的差异性。
[0018] 蛋白质（b)是在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且 具有氧化脱氢酶活性的由（a)衍生的并和（a)的氨基酸序列至少95%相同的蛋白质。
[0019] 在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBI Blastp程序进行比对，默认参数。
[0020] 本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的葡萄糖脱氢酶。优 选地，所述核酸是由SEQ ID No:2所示核苷酸序列组成的。
[0021] SEQ ID N〇:2所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境DNA，其可以从含有该核酸 的土壤或培养基中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离 获得，也可以全基因人工合成获得。
[0022] 本发明中，SEQ ID No:2所示的基因命名为BYKY-GDH，全长786bp。其中，其编码 序列（CDS)从第1个碱基起至第783个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该 序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No: 1所示。
[0023] 如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No: 1的氨基酸序列的 核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID N〇:2。本发明的氧化脱氢酶基因的核苷酸序列也可以是 编码序列表中SEQ ID No: 1所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适 当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物 可以通过对核苷酸序列SEQ ID No:2的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺 失或添加来制得。
[0024] SEQ ID N〇:2的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的启动子或信 号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能 没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子 完全替换，可提1?目标蛋白的表达水平。
[0025] SEQ ID No:2的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID No:2所示序列的多聚 核酸进行杂交的多聚核酸。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的 方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载有 被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲 液的组成为〇· lwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2~8XSSC ; 20XSSC为3M氯化钠和0. 3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50~70°C ;在培养几个小 时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组 成为6XSSC+0. lwt% SDS溶液，更优选为5XSSC+0. lwt% SDS ;当用这种清洗缓冲液清洗 完膜后，就可以通过DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
[0026] 本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的葡萄糖脱氢