醛粗品，溶于 10倍体积的NaHC03缓冲液（pH 7. 2)，直接加入15%体积的⑶Η粗酶液，300~400rpm搅拌， 控制pH 6. 8~7. 0,通气0. 3L/min，30~37°C反应3~4h，GC检测反应，结束后用乙酸乙 酯萃取三次，合并有机相，旋干得到内酯粗产物379g，纯度96. 8%，摩尔收率78%，e. e.值 >99 % 〇
[0074] 实施例10~11⑶Η转化半缩醛到内酯
[0075] 基本按照实施例9的方法转化表1中的底物。
[0076] 表1各种底物的转化
[0077]
[0078] 实施例12⑶Η转化半缩醛到内酯
[0079] 在2L的催化体系中，3Μ的（4R，6S)-6-(氯甲基）四氢-2Η-吡喃-2, 4-二醇中加 入10倍体积的NaHC03缓冲液（pH 7. 2)，加入15%体积的实施例9中制备的⑶Η粗酶液，按 照实施例9的方法反应5h后，旋干得到相应的内酯粗品461g，纯度96. 8%，摩尔收率95%， e. e.值 >99%。
[0080] 实施例13~14⑶Η转化半缩醛到内酯
[0081 ] 基本按照实施例12的方法转化表2中的底物。
[0082] 表2各种底物的转化
[0083]
[0084] 实施例15⑶Η和DERA的共表达菌株的转化得到内酯
[0085] 在2L反应体系中，加入实施例7得到的DERA-GDH发酵液800mL，实施例8得到的 NADH氧化酶200mL，30分钟内流加600mM氯乙醛和1300mM乙醛，使总体积达到2L，控制pH 6. 8~7. 0,在30~37°C反应4h，维持通气量0. 7L/min。气相检测反应进程，反应结束后 用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，旋干得到内酯粗品87. 5g，纯度96. 8 %，摩尔收率90 %， e.e.值 >99%。
[0086] 实施例16~17⑶Η和DERA的共表达菌株的转化得到内酯
[0087] 基本按照实施例15的方法转化表3中的底物。
[0088] 表3各种底物的转化
[0089]
[0090] 实施例18⑶Η的测活，反应的检测
[0091] 用于前述实施例中的GDH酶活力检测和产物检测按如下方法进行：
[0092] ⑶Η酶活力检测：每2mL反应液包括100 μ L大肠杆菌裂解液，10mM半缩醛，250 μ Μ NADP+，PBS缓冲液，340nm波长下用分光光度计检测NADPH的生成速度。
[0093] NADH氧化酶的酶活力检测：每2mL反应液包括：100 μ L大肠杆菌裂解液，10mM半 缩醛，250 μ M NADH，pH7. 0的PBS缓冲液，340nm波长下用分光光度计检测NADH的生成速 度。
[0094] 酶活单位定义为每分钟生成或消耗1 μ mol的NADH的酶量。
[0095] 产物检测：采用气相色谱法，以丙二酸二乙酯为内标，色谱柱为非极性柱，固定相 为100%聚二甲基硅氧烷；柱温501：(停留21^11)，后以101：/1^11升温到2401：;载气为氦 气；进样口温度：300°C;离子源温度250°C;两个产物峰分别在11. 3min、13. lmin ;内标峰出 峰在 8. lmin。
【主权项】
1. 一种分离的葡萄糖脱氢酶，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋白质： (a) 由SEQ ID No: 1所示氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有 氧化脱氢活性的蛋白质； (c) 和（a)的氨基酸序列具有至少90%同一性且具有氧化脱氢活性的蛋白质。2. 编码权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的分离的核酸。3. 根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQ ID No:2所示核苷酸序列组成的。4. 包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其是pET21a。7. 包含权利要求4-6任一项所述重组表达载体的重组表达转化体。8. 根据权利要求7所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌。9. 根据权利要求8所述的重组表达转化体，其是E. coli BL21 (DE3)。10. -种重组葡萄糖脱氢酶的制备方法，其包括如下步骤：培养权利要求7-9任一项所 述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组葡萄糖脱氢酶。11. 一种催化半缩醛进行氧化反应形成内酯的催化剂，其选自权利要求7-9任一项所 述的重组表达转化体的培养物，或通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其 加工的制品。12. 权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶，权利要求10所述的方法制备的重组葡萄糖脱氢 酶，或权利要求11所述的催化剂在催化半缩醛进行氧化反应形成内酯化合物中的应用。13. 根据权利要求12所述的应用，所述的半缩醛化合物选自如下式I所示的化合物： 其中，X选自离去基团、叠氮基、具有1~6个候原于的營'凰烷基、-CN、-〇H、或-COORi基团；Ri 选自具有1~6个碳原子的烷基或具有6~12个碳原子的芳基； R为Η或羟基保护基。14. 根据权利要求13所述的应用，其中，R为Η、碳链长度为1~8个碳原子的烷基或 苄基。15. 根据权利要求13所述的应用，其中，X选自卤素、磺酸酯基团、酰氧基；苯乙酰氧基、 烷氧基、芳氧基、或者R2R 3NCH2 ;其中R2、R3各自独立地选自Η、具有2~7个碳原子的烷氧 羰基、具有8~14个碳原子芳基烷氧基羰基、具有6~12个碳原子的芳基磺酸酯基、具有 7~19个碳原子芳基烷基、具有2~7个碳原子的烷基酰基或邻苯二甲酰亚氨基。16. 根据权利要求13所述的应用，其中，X为Cl，R为H。17. 根据权利要求13所述的应用，其中，式I的化合物为（4R，6S)-6-氯代甲基-2, 4-二 羟基-四氢吡喃。18. 根据权利要求13-17任一项所述的应用，其中所述的半缩醛化合物在反应液中的 浓度为1~l〇〇g/L，葡萄糖脱氢酶的用量为0. 1~10g/L，任选地，所述反应液中还添加0~ 1. OmM的吡咯喹啉醌（PQQ)，反应在振荡或搅拌条件下进行，反应温度为10~40°C。19. 一种合成6-取代甲基-4-羟基-四氢吡喃-2-酮的方法，包括使用权利要求1所 述的葡萄糖脱氢酶，权利要求10所述的方法制备的重组葡萄糖脱氢酶，或权利要求11所述 的催化剂催化半缩醛进行氧化反应形成内酯化合物。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述的氧化反应由SEQ ID No: 1所示氨基酸序 列组成的蛋白质催化，反应液中含有l〇〇g/L的半缩醛，0. 1~10g/L的葡萄糖脱氢酶，反应 pH为6. 8~7. 5,反应温度为25~37°C。21. -种合成他汀类中间体（3R，5S)-6-取代-3, 5-二羟基己酸酯的方法，包括使用权 利要求19或20所述的方法合成内酯化合物。
【专利摘要】本发明提供了一种催化活性高、反应收率高，对环境友好的葡萄糖脱氢酶进行氧化合成6-取代四氢吡喃-2-酮衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶-化学合成方法。还提供了该葡萄糖脱氢酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及，该葡萄糖脱氢酶的高效制备方法，以及该葡萄糖脱氢酶在催化半缩醛氧化成内酯中的用途。使用本发明方法制备所得的产物收率高，纯度高，溶剂易回收，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/53, C12R1/19, C12N9/04, C12P17/06
【公开号】CN105624127
【申请号】CN201410588562
【发明人】罗煜, 丁时澄, 瞿旭东, 王海涛
【申请人】南京博优康远生物医药科技有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年10月28日