用于在生物芯片上形成脂质双层的方法
【专利说明】用于在生物芯片上形成脂质双层的方法
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求2013年10月23日提交的标题为"Methods for Forming Lip id Bilayers on Biochips"的美国临时申请第61/894,661号的权益,所述临时申请通过引用 整体并入本文。
[0003] 背景
[0004] 生物芯片可用于各种类型的分子检测和感测,包括核酸分子的测序。核酸测序是 一个可用于提供核酸样品的序列信息的过程。此类序列信息在对受试者进行诊断和/或治 疗中可能是有帮助的。例如,受试者的核酸序列可用于鉴别、诊断遗传疾病,并且可能开发 针对该遗传疾病的治疗。作为另一个实例,对病原体的研究可导致针对接触性传染病的治 疗。
[0005] 有可获得的方法可用于对核酸进行测序。然而,此类方法是昂贵的,而且可能无法 在一个时间段内精确地提供对诊断和/或治疗受试者而言可能是必要的序列信息。
[0006] 概述
[0007] 纳米孔可用于检测各种分子,包括但不限于对聚合物诸如核酸分子进行测序。本 文中认识到需要改进的生物芯片和制造生物芯片(例如,包含纳米孔)的方法。在一些情况 下,常规半导体加工技术在生产用作生物芯片的硅装置中是有缺陷的。例如,提供了可生产 经受住(例如,在接触过程中或之后可运行的)高腐蚀环境诸如水溶液(例如,包含离子)的 生物芯片的方法。在另一个方面,本文所述的方法产生有助于有机膜(例如,脂质双层)形成 的生物芯片表面。在另一个方面,所述方法提供了进行生物芯片中的离子电流流的电测量 所需的电化学电极。
[0008] 除其它以外,根据本文所述的方法产生的生物芯片可用于核酸分子鉴定和聚合物 (例如,核酸)测序。在一些情况下,聚合物穿过纳米孔,而该聚合物的各种亚单位(例如,核 酸的腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和/或尿嘧啶(U)碱基)影响流过纳米 孔的电流。如本文所述,可通过在跨纳米孔和/或跨膜施加的多个电压下测量电流来鉴定各 种亚单位。在一些情况下,标记的核苷酸的聚合将标签分子释放和/或呈递至纳米孔,所述 标签分子可通过在多个跨纳米孔和/或膜施加的电压下测量电流来鉴定。
[0009] 在一个方面,本公开提供了用于形成用于纳米孔感测装置的脂质双层的方法,所 述方法包括:(a)提供包含与多个感测电极流体连通的流体流路的芯片;(b)使脂质溶液流 入流体流路;和(c)使至少一个气泡流至流体流路上,从而形成与感测电极相邻的脂质双 层,其中所述气泡横跨多个感测电极,并且其中所述气泡与感测电极相邻,持续至少约1秒。 在一些实施方案中,所述气泡与感测电极相邻,持续约lms至约5分钟之间。
[0010]在一些实施方案中,所述气泡与感测电极相邻,持续至少约30秒。在一些实施方案 中,所述气泡与感测电极相邻,持续至多约5分钟。在一些实施方案中,在至少50%的感测电 极上方形成脂质双层。在一些实施方案中,在至少70%的感测电极的上方形成脂质双层。
[0011]在一些实施方案中,所述方法还包括将纳米孔插入与每一个感测电极相邻的脂质 双层。在一些实施方案中,所述芯片包含小孔,并且其中所述感测电极存在于小孔中。
[0012] 在另一个方面,本公开提供了用于形成用于纳米孔感测装置的脂质双层的方法, 所述方法包括:(a)提供包含与多个感测电极流体连通的流体流路的芯片;(b)使至少一个 气泡流入流体流路并与所述多个感测电极相邻,以使得所述气泡横跨多个感测电极;和(c) 将气泡的周边与脂质接触,其中所述脂质在气泡下方扩散并扩散至流体流路上,从而形成 与感测电极相邻的脂质双层。
[0013] 在一些实施方案中,使所述气泡与脂质接触至少约30秒。在一些实施方案中,使所 述气泡与脂质接触约5ms至约5分钟。在一些实施方案中,在至少70%的感测电极上方形成 脂质双层。在一些实施方案中,所述方法还包括将纳米孔插入与每一个感测电极相邻的脂 质双层。在一些实施方案中,所述纳米孔为耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋 白A(MspA)、a-溶血素、与耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)或α-溶血素中的至少一个具有至少 70%同源性的任何蛋白质,或其任意组合。
[0014] 在一些实施方案中,插入纳米孔包括通过所述电极施加电刺激,以促进所述纳米 孔在所述脂质双层中的插入。在一些实施方案中,所述脂质双层表现出大于约1GQ的电阻。
[0015] 在一些实施方案中,所述脂质双层和所述纳米孔蛋白一起表现出约16Ω或更小的 电阻。在一些实施方案中,所述脂质包含有机溶剂。在一些实施方案中,所述气泡为蒸汽气 泡。在一些实施方案中,所述芯片包含小孔,并且所述感测电极存在于小孔中。
[0016] 在一些实施方案中,所述脂质选自由以下组成的组:二植烷酰基-磷脂酰胆碱 (DPhPC)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱、1,2-二-0-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DoPhPC)、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱(P0PC)、二油酰基-磷脂酰甲酯(D0PME)、二棕榈酰 基磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷 脂酰甘油、鞘磷脂、1,2_二-0-植烷基-sn-甘油;1,2_二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-350];1,2_二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二 醇)-550]; 1,2_二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750]; 1,2_二 棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]; 1,2_二棕榈酰基-sn-甘 油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000];1,2_二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-乳糖基;GM1神经节苷脂、溶血磷脂酰胆碱(LPC)或其任意组合。
[0017] 在另一个方面,本公开提供了纳米孔传感系统,其包括:(a)包含与多个感测电极 流体连通的流体流路的芯片,其中每一个所述感测电极被配置来检测核酸掺入事件后的离 子电流;和(b)耦接于所述芯片的控制系统,所述控制系统被编程来:(i)将脂质溶液流入流 体流路;(ii)将至少一个气泡流入流体流路并与感测电极相邻,持续至少约1秒的时间段, 其中所述气泡横跨多个感测电极,并且其中所述气泡至流体流路的流动形成与感测电极相 邻的脂质双层。在一些实施方案中,所述气泡与感测电极相邻,持续约5ms至约5分钟之间的 时间段。
[0018] 在一些实施方案中,所述芯片包含小孔,并且其中所述感测电极存在于小孔中。在 一些实施方案中,控制系统在所述芯片外部。在一些实施方案中,控制系统包含计算机处理 器。在一些实施方案中,所述方法还包括可操作地耦接于所述控制系统和所述芯片的流体 流动系统,其中所述流体流动系统被配置来引导所述脂质溶液和所述气泡的流动。
[0019] 通过以下的详细描述(其中仅显示并描述了本公开的说明性的实施方案),本公开 的其它方面和优点对本领域技术人员而言将变得显而易见。正如将会认识到的,本公开能 够有其它不同的实施方案,并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改,所有这些都 不脱离本公开内容。因此,实际上附图和说明将被视为说明性的,而非限制性的。
[0020] 通过引用并入
[0021] 本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文,其程度如 同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利和专利申请通过引用而并入。
[0022] 附图简述
[0023] 本发明的新颖特征在随附的权利要求中具体阐述。通过参考以下对在其中利用到 本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述,将会获得对本发明的特征和优点的更 好的理解,并且在所述附图中:
[0024]图1显示基于小孔的电传感器;
[0025] 图2显示纳米孔生物芯片;
[0026]图3显示其中容器兼作对电极的电极阵列;
[0027]图4显示具有普通对电极的电极阵列;
[0028]图5显示其中传感器条共有共同对电极的电极阵列;
[0029] 图6显示其中每一个电极具有独立的对电极的电极阵列;
[0030] 图7显示成行的共有共同电解质池的传感器小孔的实例;
[0031]图8显不半导体衬底的实例;
[0032]图9显示一层沉积在半导体衬底上的二氧化硅;
[0033]图10显示沉积在二氧化硅层上的光致抗蚀剂;
[0034]图11显示暴露于辐照以界定小孔的区域的光致抗蚀剂的区域;
[0035]图12显示通过干法蚀刻程序除去的二氧化硅的一部分;
[0036]图13显示通过湿法蚀刻程序除去另外的二氧化硅以产生小孔;
[0037]图14显示钛粘附层的沉积;
[0038]图15显示氮化钛保护层的沉积,以铂保护层或可选择地铂作为电极;
[0039]图16显示银电极材料的沉积;
[0040]图17显示光致抗蚀剂和配置于其上的材料的剥离;
[0041 ]图18显示二氧化硅的硅烷化;
[0042]图19显示利用凝胶填充小孔;
[0043]图20显示在小孔上方产生具有纳米孔的膜;
[0044] 图21显示其中银电极发生在小孔的侧壁上的生物芯片;
[0045] 图22显示保持与多个电极相邻的大的气泡;
[0046]图23显示用于在预处理的传感器芯片的一个或多个流动通道上的电极上方形成 脂质层的方法的实例;
[0047]图24显示半导体传感器芯片的实例;
[0048] 图25显示示例性流动池的构型;
[0049] 图26显示封装芯片的实例;和
[0050] 图27显示用栗自动化的双层形成及弹出的实例。
[0051] 图28为自动芯片设置的流程图。该测试将确认芯片上的大部分池是可接受的。如 果不足量的池(如由操作者决定的)通过测试,则整个芯片失败。
[0052]图29为用于双层形成的自动栗的流程图。
[0053]图30为在传感器芯片的小孔上方各种溶液和/或气泡的流动的举例说明。流动方 向通过简图的右下角中的方框箭头指示。在该图中,第一个矩形表示离子溶液(3001;草皮 图案的矩形)已流过小孔(3010)上方,脂质溶液(3015;带交叉线的矩形)在芯片上(以及在 本描述中覆盖所有小孔),并且第二个和第三个矩形表示离子溶液,以及气泡(3005;空白矩 形)仍然未流至芯片上方。矩形的尺寸不代表流体的量或气泡的尺寸。可重复离子溶液-气 泡-离子溶液顺序数次,以增加双层覆盖,减小非双层覆盖,例如脂质在小孔上的多层堆积, 和/或在弹出测试后重建双层。一旦进行本文所述的方法,则脂双层脂质双层将在小孔(显 示的)的界面(3020)或大体上平面的电极(未显示的)上形成。
[0054] 详述
[0055] 虽然本文已经显示并描述了本发明的各种实施方案,但是对本领域技术人员显而 易见的是,此类实施方案仅以实例的方式提供。在不脱离本发明的情况下,本领域技术人员 将会想到许多变化、改变和替代。应当理解,可以使用本文所述本发明的实施方案的各种替 代方案。
[0056] 本文中所用,术语"纳米孔"一般是指在膜中形成的或以其它方式提供的小孔、通 道或通路。膜可以是有机膜,如脂质双层,或合成膜,如由聚合材料形成的膜。膜可以是聚合 材料。纳米孔可被配置成邻近或接近感测电路或与感测电路耦接的电极,所述感测电路诸 如例如互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路。在一些实例中,纳米孔具 有0.1纳米(nm)至约lOOOnm级别的特征性宽度或直径。一些纳米孔是蛋白质。α-溶血素是蛋 白质纳米孔的一个实例。
[0057] 如本文中所用,术语"聚合酶"一般是指能够催化聚合反应的任何酶。聚合酶的实 例包括但不限于核酸聚合酶或连接酶。聚合酶可以是聚合作用的酶。
[0058]如本文中所用,术语〃核酸〃一般是指包含一个或多个核酸亚单位的分子。核酸可 包括选自腺苷(A )、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(Τ )和尿嘧啶(U)或其变体的一个或 多个亚单位。核苷酸可包括A、C、G、T或U,或其变体。核苷酸可包括任何可被掺入生长中的核 酸链的亚单位。此类亚单位可以是A、C、G、T或U,或者是对一个或多个互补A、C、G、T或U具有 特异性的,或与嘌呤(即A或G,或其变体)或嘧啶(即C、T或U,或其变体)互补的任何其它亚单 位。亚单位可使得单个核酸碱基或成组的碱基(例如,AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA 或其尿嘧啶对应物)能够被分辨。在一些实例中,核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸 (RNA),或其衍生物。核酸可以是单链的或双链的。
[0059] 〃多核苷酸"或"寡核苷酸"为包含一个或多个如本文中定义的核苷酸的聚合物或 寡聚物。多核苷酸或寡核苷酸可包含DNA多核苷酸或寡核苷酸、RNA多核苷酸或寡核苷酸,或 DNA多核苷酸或寡核苷酸和/或RNA多核苷酸或寡核苷酸的一个或多个部分。
[0060] 如本文中所用,"核苷酸"或"碱基"可以是基本核苷酸或核苷酸类似物。基本核苷 酸是脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧胞苷单磷酸(dCMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、脱氧胸苷单 磷酸(dTMP)、腺苷单磷酸(AMP)、胞苷单磷酸(CMP)、鸟苷单磷酸(GMP)或尿苷单磷酸(UMP)。 核苷酸类似物是在基本核碱基(A、C、G、T和U )、脱氧核糖/核糖结构、基本核苷酸的磷酸基团 或其任意组合上具有修饰的基本核苷酸的类似物或模拟物。例如,核苷酸类似物可具有经 修饰的碱基,无论是天然存在的还是人造的。经修饰的碱基的实例包括但不限于甲基化的 核碱基、经修饰的嘌呤碱基(例如,次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、isodG)、经修饰的嘧啶 碱基(例如,5,6_二氢尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶、isodC)、通用碱基(例如,3-硝基吡咯和5-硝 基吲哚)、非结合性碱基模拟物(例如,4-甲基苯并咪唑和2,4_二氟甲苯或苯)以及无碱基 (无碱基核苷酸,其中核苷酸类似物不含碱基)。具有经修饰的脱氧核糖(例如,双脱氧核苷, 如双脱氧鸟苷、双脱氧腺苷、双脱氧胸苷和双脱氧胞苷)和/或磷酸结构(统称为骨架结构) 的核苷酸类似物的实例包括但不限于二醇核苷酸、吗啉代核苷酸和锁定核苷酸。
[0061] 术语〃百分比同源性〃在本文中可与本文中的术语〃百分比同一性〃互换使用,并且 是指当使用序列比对程序进行比对时,编码本发明的多肽中任何一个的核酸序列或本发明 的多肽的氨基酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。
[0062] 例如,如本文中所用,80%同源性与通过确定的算法测定的80%序列同一性意指 同一件事,并且相应地给定的序列的同源物在给定的序列的长度上具有大于80%的序列同 一性。序列同一性的示例性水平包括,但不限于80、85、90、95、98%或更大的与给定的序列 例如本发明的多肽的任一个的编码序列的同一性,如本文中描述的。
[0063] 可用于测定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括,但不限于,可在因 特网上公开获得的BLAST程序的套件,例如,BLASTN、BLASTX以及TBLASTX、BLASTP和 TBLASTN。也参见,Altschul 等,1990 和 Altschul 等,1997。
[0064]当相对于GenBank DNA序列和其它公共数据库中的核酸序列评价给定的核酸序列 时,通常使用BLASTN程序进行序列搜索。BLASTX程序对于针对GenBank蛋白质序列和其它公 共数据库中的氨基酸序列搜索在所有阅读框架中已被翻译的核酸序列是优选的。使用为 11. 〇的开放缺口罚分和1. 〇的延伸缺口罚分的默认参数以及利用BL0SUM-62矩阵进行 BLASTN和BLASTX。(参见,例如,Altschul,S.F.等,Nucleic Acids Res .25 :3389-3402, 1997.)
[0065] 使用例如Mac Vec tor 13 · 0 · 7版中的CLUSTAL-W程序(利用默认参数(包括10 · 0的开 放缺口罚分、0.1的延伸缺口罚分和BL0SUM 30相似性矩阵)运行的)进行所选定的序列的优 选比对(以测定两个或更多个序列之间的"百分比同一性")。
[0066] 生物芯片和核酸测序
[0067] 基于小孔的传感器(例如,生物芯片)可用于单分子的电询问(e 1 e c t r 〇 -interrogation)。本公开的基于小孔的传感器可包括在邻近或靠近感测电极配置的膜中形 成的纳米孔。所述传感器可包括对电极。所述膜包括反侧(即,面对感测电极的面)和顺侧 (8口,面对对电极的面)。
[0068] 现将参考附图,其中类似的数字始终是指类似的部分。应理解,本文中的数字和特 性不一定按比例绘制。
[0069] 参考图1,可在与小孔密切相关(例如,结合可以是化学的、机械的、电的或电化学 的)的测试下对分子进行典型的电测量。系统可在分子/孔复合物的两端施加刺激(电压或 电流)并测量响应。为了隔离对孔/分子复合物的测量,一般利用高度绝缘的材料(例如,月旨 质双层)隔离小孔的两侧。
[0070] 绝缘阻挡层的相对侧上密封的体积根据目标种类(例如,核酸分子或标签分子)在 检测过程中从顺侧移动至反侧的一般定义,被称为顺侧孔和反侧孔。反侧孔一般是与芯片 电极接近并与其电连接的绝缘膜的一侧。
[0071] 图2显示具有温度控制的纳米孔生物芯片(或传感器)的实例,如可根据美国专利 申请公布第2011/0193570号(其通过引用整体并入本文)中描述的方法制备的。参考图2,纳 米孔检测器包含与导电溶液(例如,盐溶液)207接触的顶部电极201。底部导电电极202在纳 米孔206附近、与其相邻或与其接近,所述纳米孔被插入在膜205中。可将膜205配置在小孔 210上方,或直接在电极上方,其中传感器202形成小孔的表面的部分。在一些情况下,将底 部导电电极202嵌入其中电路被嵌入半导体衬底204中的半导体203中。半导体203的表面可 被处理为疏水性的。将被检测的分子穿过纳米孔206中的孔。将半导体芯片传感器置于封装 208中,并且该封装又与温度控制元件209相邻。温度控制元件209可以是热电加热和/或冷 却装置(例如,Peltier装置)。多个纳米孔检测器可形成纳米孔阵列。
[0072] 在一些实施方案中,所述生物芯片包含能够与小孔中的电极形成电路的对电极。 在一些情况下,多个小孔中的多个电极共有共同的对电极。图3显示具有共同对电极的电极 阵列,其中液体容器周边(例如,容器)用作对电极(例如,是导电的并且形成电路)。对电极 的另一个实施方案示于图4中,其中对电极为在纳米孔的顶部上方的平板(例如,由导电金 属制成的)。如图5和图6中显示的,可将多个小孔中的多个电级组织成共享共同对电极的组 中。在一些情况下,(例如,图6),多个小孔中的多个电极各自具有专用对电极。在一些情况 下,具有多个对电极可允许个别感测电极,或仅少数感测电极与单个对电极配对,从而潜在 地改善感测-对电极对的电响应和性能。
[0073]在一些情况下,多个小孔(包括小孔的总数的任何亚组)包含共同的电解质池。如 图7中显示的,小孔701可被壁702分成行,以使得成行的小孔在小孔的上方共有共同的电解 质池。如此处所述将生物芯片分隔成部分可允许在单个生物芯片(例如,通过将不同样品置 于芯片的不同部分中)上分析多个样品。
[0074]纳米孔传感器可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100或1000个与 电极(例如,底部导电电极202)相邻的纳米孔(例如,溶血素或水通道蛋白等或其组合)。纳 米孔传感器可包括仅供纳米孔传感器(而非其它传感器)使用的顶部电极(例如