个或多个流动通道上的电极上方形成脂质双层的方法包括：（a)使包含至少一种类 型的脂质的脂质溶液流动通过每个流动通道；（b)将脂质沉积于芯片的表面上；（c)在每个 流动通道中用后继或另外的气泡使沉积的脂质变光滑并变薄；（d)进一步将缓冲溶液流动 通过每一个流动通道，所述缓冲溶液是导电的；（e)测量通过电极的电流，以确定在每个电 极上方是否形成脂质双层；以及(f)如果尚未在任何电极上形成脂质双层，则任选地向至少 一个电极施加刺激，以诱导表面上的脂质在电极上方形成脂质双层。所述刺激可包括针对 传感器芯片的电脉冲、超声脉冲、压力脉冲和声脉冲中的至少一个，或缓冲液（约5.0至约 8.5的pH范围）、离子溶液(例如，NaCl、KC1;约75mM至约1M)、气泡、化学物质（例如，己烷、癸 烷、十三烷等）、物理运动、电刺激或电刺激脉冲、压力或压力脉冲、温度或温度脉冲、超声脉 冲和/或声脉冲的任意组合。
[0192] 在一些实施方案中，所述脂质溶液包含至少两种类型的脂质。在一些实施方案中， 所述脂质溶液还包含至少一种类型的孔蛋白。
[0193] 在一些实施方案中，在(c)后：引导包含孔蛋白的非脂质溶液流过每个流动通道中 沉积的脂质。随后可利用每一个流动通道中的第二气泡使孔蛋白和沉积的脂质变薄。可以 以任意顺序或组合重复上述操作至少1次、2次、3次、4次、5次或更多次。
[0194] 在一些情况下，可引导孔蛋白溶液、额外的空气气泡和额外的液态溶液流动通过 流动通道。可通过空气气泡分隔孔蛋白溶液与液态溶液。随后，可通过至少一些、全部或大 体上全部电极向传感器芯片施加刺激，例如，缓冲液（约5.0至约8.5的pH范围）、离子溶液 (例如，NaCl、KC1;约75mM至约1M)、气泡、化学物质(例如，己烷、癸烷、十三烷等）、物理运动、 电刺激或电刺激脉冲、压力或压力脉冲、温度或温度脉冲、超声脉冲和或声脉冲的任意组 合，以促进孔蛋白在脂质双层中的插入。
[0195] 在一些实施方案中，所述脂质为二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)、棕榈酰基-油酰 基-磷脂酰胆碱(P0PC)、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱、1，2-二-0-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DoPhPC)、二油酰基-磷脂酰甲酯(D0PME)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、溶血 磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰 甘油、1，2_二-0-植烷基-sn-甘油；1，2_二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚 乙二醇)-350]; 1，2_二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇)-550]; 1， 2_二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750]; 1，2_二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000] ;1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇 胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000 ]; 1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-乳糖基;GM1神 经节苷脂或鞘磷脂。
[0196] 在一些情况下，至少一些液态脂质溶液含有有机溶剂(例如癸烷）。所述孔蛋白，在 一些实例中，可包含耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)或α-溶血素。在一些情况下，所述缓冲溶 液含有包含一种或多种离子的离子溶液(例如，氯化钠或氯化钾）。在一些实例中，至少一些 缓冲溶液含有氰化亚铁或抗坏血酸。在一些情况下，所述缓冲溶液还可含有谷氨酸钠、谷氨 酸钾、四甲基氯化铵、四乙基氯化铵、氯化铵、氰化亚铁、氰化铁、醋酸钾等。在一些情况下， 所述缓冲溶液还可含有海藻糖、蔗糖或任何其它糖类。在一些情况下，所述缓冲溶液还可含 有二价诸如氯化镁、氯化钙、氯化锶、氯化锰等。
[0197] 在一些实施方案中，气泡和/或流体的压力大体上等于或略高于大气压。所述气泡 可具有大于大气压的压力，诸如在lOlkPa至1013kPa的量级的压力下。
[0198] 金属电极的表面是亲水性的。在当电极可以不是金属诸如导电硅的情况下，可在 硅烷化过程期间向电极施加电位电压或变化的电位电压，以阻止硅烷粘附于非金属电极和 与其反应。可使用± 1 OmV直至± 2V的电压和不同浓度的低离子缓冲液与硅烷的混合物。还 可能通过循环电极处的电压和沉积后"烧掉"硅烷来从金属或非金属电极除去任何反应的 或残留的硅烷。对于非金属电极，在烧掉疏水性硅烷步骤后，可添加亲水性硅烷步骤，并且 将仅打开电极上方的空间以与硅烷反应。结果为不是疏水且不是亲脂的而应当是亲水的电 极表面。
[0199] 在一些情况下，除电极以外的流动通道的表面是疏水性的。在一些实施方案中，所 述流动通道(除电极以外）的表面可以是疏水性的、亲水性的或其任意组合。可针对不同的 特征处理不同的表面(壁或通道底面）。
[0200] 在一些实施方案中，在(a)之前，可通过硅烷化，化学处理除电极以外的流动通道 的表面或对所述表面使用或设计特殊材料，来使除电极以外的流动通道的表面为疏水性 的；可在芯片的表面上形成多个流动通道;可在每一个流动通道的表面上制造电极;可通过 沿流动通道构建导轨来分隔流动通道;可在每一个导轨的侧面制造电极;和/或可使每一个 流动通道的顶侧密封。
[0201] 在一些情况下，可通过使离子溶液流过芯片来产生具有双层的芯片。所述流可以 是离散的脂质溶液和离子溶液等分(例如，交替的脂质溶液与离子溶液）的"串"。所述流可 穿过供应管和横穿芯片。在一些实例中，串可具有至少或约0.1uL、luL、2uL、3uL、4uI^5uL 的液体，和从而至少或约〇.1此、11^、21^、31^、4此或51^的离子溶液，并且可被重复1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10次或更多次。溶液的串可被来回栗送穿过生物芯片的表面约2、3、4、5、6、7、 8、9、10或更多次。随后可电检查覆盖和/或密封。在一些实施方案中，脂质和/或离子溶液的 串可为约O.luL至约lOOOuL之间。
[0202] 在一些情况下，随后对溶液的串进行装配操作。装配操作可涉及使气泡流动穿过 芯片。在一些情况下，可将电气方法用于检查池(包括电极）的覆盖和/或每一个电极处的泄 漏或密封电阻。
[0203] 在一些情况下，重复所述装配操作直至获得至少一些或所有以下测试结果：（1)至 少约 100、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250个或更多个电极被覆盖；（2)在 低于-IV的施加电压下弹出至少约100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个膜 (例如，脂质层）；（3)在(2)中弹出的脂质层当中，至少40、50、60、70、80、90、100或更多个已 在约-300mV至-700mV之间弹出；（4)具有小于约50吉欧姆的密封电阻的电极的数目少于30、 20、15或10个;和（5)如果显示任何记录的泄漏电流的池的数目超过50个，则密封电阻的中 位数大于150吉欧姆。在一些情况下，重复装配操作直至获得至少一些或全部以下测试结 果：（1)至少约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多，例如， 100% 的电极被覆盖；（2)至少约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或更多，例如，100%的膜(例如，脂质层)在小于± IV的施加电压下被弹出；（3)在(2)中弹出 的脂质层中，至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多例如 100 %在约± 300mV至± 700mV之间弹出；和(4)具有大于10吉欧姆的池的最少数(例如，至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%) 〇
[0204]如果这些标准的一部分或全部都已满足，则可使具有约10微升(uL)至约lOOOuL之 间的任何尺寸的气泡流过芯片，随后使一定量的缓冲液(例如，约10uL至约10mL)流过芯片， 并且可以进行（1)、（4)和(5)的最终测试。如果通过测试，则所述程序移至孔插入方案。所述 程序可借助于计算机系统执行(例如，由处理器执行）。
[0205] 在一些情况下，孔插入方案包括向芯片施加至少或约0 . luL、1uL、2uL、3uL、4uL、 5uL或高达约lmL的孔蛋白溶液，并施加刺激，例如电穿孔以向双层中插入孔。在电穿孔操作 结束时，可检查芯片的孔产率，如果通过该标准，则施加样品和测试试剂。
[0206] 双层产生和孔插入的总时间可以是任何合适的值。在一些情况下，总时间为约1分 钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时或约2小时。在一些情况下， 总时间少于约1分钟、少于约5分钟、少于约10分钟、少于约20分钟、少于约30分钟、少于约45 分钟、少于约1小时或、或少于约2小时。在一些情况下，约10 %、约20 %、约30 %、约40 %、约 50%、约60%、约70%、约80%或约90 %的总时间用于双层形成。可在双层形成和孔插入之 间分割总时间的任何比例。在一些情况下，形成双层，并同时插入纳米孔。在一些情况下，双 层和孔插入的总时间平均为，15分钟的双层生成和20分钟的孔插入，总共35分钟。
[0207] 任何数量的小孔可被具有插入的孔(例如，孔产率)的膜(例如，脂质双层)覆盖。在 一些情况下，所述孔产率为约10 %、约20 %、约30 %、约40 %、约50 %、约60 %、约70 %、约 80%、约90%等。在一些情况下，所述孔产率为至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少 约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%等。
[0208] 在一些实施方案中，施加于电极芯片和试验装置的参数为1MKC1或300mM NaCl，pH 7.5(在约5.0至约8.5的pH范围）、当前流体流动速率(例如，约luL/秒至约1000uL/秒之间）、 海平面大气压和室温。
[0209] 使用凝胶支持膜
[0210] 在一个方面，用于形成生物芯片或传感器的方法包括用适合于膜(例如，包含纳米 孔的脂质双层)的粘附的层涂覆衬底。所述衬底可用有机官能烷氧基硅烷分子进行硅烷化。 图18显示了其中可将膜配置于硅烷化表面上的生物芯片。
[0211] 在一些情况下，膜难以形成和/或不稳定，这至少部分归因于膜在硅烷化的二氧化 硅上被支持，但在小孔上方不被支持。应当认识到并且在本文中描述了用凝胶填充小孔可 以支持在小孔区域上方的膜，从而使得更容易形成膜和/或使该膜稳定。在一些实施方案 中，小孔的空部中填充有凝胶，如图19中显示的。所述凝胶可为配置于小孔上方的膜提供机 械支持。
[0212]在其它实施方案中，可通过使用包含海藻糖或其它糖类的缓冲液来使膜化学稳 定。
[0213] 在一个方面，用于制备生物芯片的方法包括：（a)将凝胶沉积至与电极和感测电路 接近的小孔中；和(b)在小孔上方形成膜，其中所述膜至少部分地被凝胶支持。
[0214] 在各种实施方案中，凝胶是非反应性的，交联的，包含液体电解质，或其任意组合。 凝胶可包括但不限于标准试剂凝胶诸如琼脂糖和市售专有凝胶基质。实例是胶原蛋白、层 粘连蛋白、水凝胶、Q凝胶(QGe 1)和HydroMax凝胶。
[0215] 纳米孔的插入
[0216] 在一些情况下，将纳米孔插入膜中（例如，通过电穿孔）。可通过刺激信号诸如电刺 激、压力刺激、流体流动刺激、气体气泡刺激、超声、声、振动或其任意组合来插入纳米孔。所 述纳米孔可以是蛋白质纳米孔诸如α-溶血素或耻垢分枝杆菌(MspA)纳米孔或与α-溶血素 或MspA的任一个具有至少约70 %同源性的纳米孔。
[0217]在一些实施方案中，插入纳米孔包括通过所述电极施加刺激(例如，电穿孔脉冲） 以促进所述纳米孔的插入。在一些情况下，在这之后进行第二电检测脉冲来检测所述纳米 孔在所述脂质双层中的插入。可快速和/或多次地并以顺序变化的用于电穿孔脉冲的电压 水平重复利用电穿孔脉冲和随后检测脉冲，直至孔被插入和实现检测。在一个实施方案中， 初始电穿孔脉冲为约50mV (正的或负的），重复1至10次，每一个后续批次的电穿孔脉冲以约 lmV从先前的电穿孔脉冲递增至约± 700mV的最大值，即，阶梯递增电压。在每一个电穿孔脉 冲之间的检测脉冲为+160mV。因此，例如，将纳米孔插入脂质双层的过程将是50mV电穿孔脉 冲的施加和检测脉冲的施加(5次），51mV电穿孔脉冲的施加和检测脉冲的施加(5次)等。重 复该过程，直至纳米孔被插入，在该情况下，关闭电极，或直到电极/小孔被拒绝或被判定为 已失败。
[0218] 在一些情况下，酶，例如聚合酶(例如，DNA聚合酶)或其它酶(例如，逆转录酶），被 连接至纳米孔和/或位于纳米孔附近。可在将纳米孔掺入膜之前或之后，将聚合酶/酶附着 于纳米孔。在一些情况下，所述纳米孔和聚合酶/酶为融合蛋白（即，单条多肽链）。应理解的 是，虽然贯穿始终以聚合酶为例，但可使用任何合适的酶。
[0219] 可以以任何合适的方式将聚合酶附着于纳米孔。在一些情况下，将聚合酶附着于 溶血素蛋白单体，然后装配完整的纳米孔七聚体(例如，以一个具有附着的聚合酶的单体对 6个无附着的聚合酶的溶血素单体的比率）。随后将纳米孔七聚体插入至膜中。
[0220] 用于将聚合酶附着于纳米孔的另一种方法涉及将接头分子附着于溶血素单体或 使溶血素单体突变以具附着位点，随后装配完整的纳米孔七聚体(例如，例如，以一个具有 接头和/或附着位点的单体对6个无接头和/或附着位点的溶血素单体的比率）。应当理解， 可利用具有接头和/或附着位点的单体(H+)与无接头和/或附着位点的溶血素单体(Η?的组 合来实现具有任何比率的亚单位的七聚体溶血素纳米孔，例如，（Η+) 2(!Γ)5、（Η+)3(!Π 4、（Η + )40-)3等。随后可将聚合酶附着于附着位点或附着接头(例如，在插入膜之前，以散装形式 存在）。还可在于膜中形成(例如，七聚体)纳米孔之后，将聚合酶附着于附着位点或附着接 头。在一些情况下，将多个纳米孔-聚合酶对插入生物芯片的多个膜(例如，配置在小孔和/ 或电极上方的）。在一些情况下，在各电极上方的生物芯片上发生聚合酶至纳米孔复合物的 附着。
[0221] 可以以任何合适的化学方法(例如，共价键和/或接头)将聚合酶附着于纳米孔。在 一些情况下，利用分子钉(molecular staple)将聚合酶附着于纳米孔。在一些情况下，分子 钉包含三个氨基酸序列（指示的接头A、B和C)。接头A可从溶血素单体延伸，接头B可从聚合 酶延伸，以及接头C可结合接头A和B(例如，通过环绕接头A和B)并从而将聚合酶附着于纳米 孔。接头C也可被构建为接头A或接头B的部分，从而减少接头分子的数目。接头也可以是生 物素和链霉抗生物素蛋白。
[0222] 在一些情况下，使用Solul ink?化学将聚合酶连接于纳米孔。Solul ink?可以是 HyNic(6-肼基-烟酸，一种芳香肼)与4FB(4-甲酰基苯甲酸酯，一种芳香醛)之间的反应。在 一些情况下，使用点击化学(Click chemistry)(例如可从LifeTechnologies获得的）将所 述聚合酶连接于纳米孔。在一些情况下，将锌指突变引入溶血素分子，随后使用分子(例如， DNA中间体分子)将聚合酶连接于溶血素上的锌指位点。
[0223]用于检测双层形成的方法
[0224] 在试图于上述传感器上产生双层后，可施加电刺激以确定双层是否已被建立或电 极是否被非双层的层简单地覆盖。进行该过程的一个方法是向层覆盖的电极施加非破坏性 AC刺激，和寻找指示电极被薄的电容性脂质双层(或其它薄层)覆盖的电容电流应答。
[0225] 如果检测到盐、电压和电极直径条件的合适的电容读数，则可推断出双层已在电 极上方产生，并且操作者准备开始孔插入步骤。
[0226] 或者，可对阵列的每一个电极施加按顺序递增的电压脉冲的破坏性应用，并且记 录电极上方的层破裂时的电压。如果看到的横跨可接受的数目的电极的电压对应于对于 盐、电压和电极直径条件所预期的双层破裂电压，则使单个气泡流过芯片，重建双层，并且 操作者准备开始孔插入步骤。
[0227] 用于形成小孔和纳米孔装置的系统
[0228] 本公开的另一方面提供用于形成纳米孔装置(包括小孔)的系统。此类系统可用于 形成与小孔或电极相邻的膜(例如，脂质双层），并将纳米孔插入膜中。
[0229] 所述系统可包括沉积系统、与沉积系统流体连通的栗送系统和具有用于执行机器 可读代码(执行用于形成小孔的方法）的计算机处理器(在本文中也称为"处理器"）的计算 机系统(或控制器）。所述代码可执行本文中提供的任何方法。栗送系统可被配置来清除或 排除沉积系统。在一些情况下，所述沉积系统被排除。
[0230] 所述沉积系统可包括一个或多个反应空间以形成小孔的材料层。在某些情况下， 所述沉积系统是具有一个或多个互连的反应室的卷对卷式(roll-to-roll)沉积系统，其可 彼此流体隔离(例如，在小室之间的位置处借助于吹扫或抽吸）。
[0231] 可将一个或多个沉积系统用于形成小孔。沉积系统可被配置用于各种类型的沉积 技术，诸如，例如，化学气相沉积(CVD)、原子层沉积(ALD)、等离子体增强CVD(PECVD)、等离 子体增强ALD(PEALD)、金属有机CVD(MOCVD)、热丝CVD(HWCVD)、初始化CVD(iCVD)、改进的 CVD(MCVD)、气相轴沉积(VAD)，外部气相沉积(0VD)和物理气相沉积(例如，溅射沉积、蒸发 沉积）。沉积系统可被配置来使得使用各种半导体制造技术诸如光刻来进行逐层形成。
[0232] 栗送系统可包括一个或多个真空栗，诸如一个或多个涡轮分子的（"涡轮"）栗、扩 散栗、离子栗、低温（"低温"）栗和机械栗。栗可包括一个或多个前级栗。例如，祸轮栗的备用 栗可以是机械栗。
[0233] 在一些情况下，借助于沉积系统在衬底上形成包含一个或多个小孔的阵列。可借 助控制器调节沉积。在一些实施方案中，控制器被配置来调节一个或多个工艺参数，诸如衬 底温度、前体流动速率、生长速率、载气流速和沉积室压力。所述控制器包括被配置来帮助 执行机器可执行代码的处理器，所述代码被配置执行本文中提供的方法。将所述机器可执 行代码存储在物理存储介质诸如闪存、硬盘或被配置来存储计算机可执行代码的其它物理 存储介质上。
[0234] 可将控制器耦接至该系统的各种组件。例如，控制器可与所述一个或多个沉积系 统和/或流体流动系统(例如，栗送系统)通信。所述控制器可与所述栗送系统通信，这可使 控制器能够调节外壳的压力。
[0235] 控制器可被编程或以其它方式配置来调节一个或多个工艺参数，诸如衬底温度、 前体流动速率、生长速率、载气流速、前体流动速率和沉积室压力。所述控制器，在一些情况 下，与沉积室的阀门或多个阀门通信，所述阀门帮助终止(或调节)前体在沉积室中的流动。 所述控制器包括被配置来帮助执行被配置来执行本文中提供的方法的机器可执行代码的 处理器。所述机器可执行代码被存储在物理存储介质诸如闪存、硬盘或被配置来存储计算 机可执行代码的其它物理存储介质上。所述控制器也可被用于调节膜和/或孔的形成，诸如 脂质溶液至流体流路中的流动，一个或多个气泡在流体流路中的流动，以及一个或多个刺 激(例如，电刺激)的施加。
[0236] 本文中提供的系统和方法的方面可体现在编程中。技术的各个方面可被认为是通 常以机器(或处理器)可执行代码的形式存在的"产品"或"制品"和/或在一种类型的机器可 读介质上运行或体现的相关数据。机器可执行代码可被存储在电子存储单元上，诸如存储 器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘。"存储"型介质可包括计算机、 处理器等的任何或所有的有形存储器或其关联模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、 磁盘驱动器等，其可在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。整个