43] 将多肤Ac-IsSLKGQ-N出在缓冲溶液化pes缓冲溶液的作用下，稀释至浓度为8mM，经 满旋、超声后，置于8 5 °C水浴中加热并冷却至室溫，加入谷氨酷胺转氨酶 (Transglutaminase，TGase)，使TGase的终浓度为0.9U/mL，分别37 °C解育。24小时和 15天 后，能够形成水凝胶。经过流变学测试，如图4所示，Ac-IsSLKGQ-N此多肤水凝胶的储能模量 G'约为800Pa，耗能模量G"约为储能模量G'的1/10,说明体系形成了典型了水凝胶。
[0044] 水凝胶降解测试：在37°C下，向自组装形成的水凝胶中加入基质金属蛋白酶II (MMP-2)，使之终浓度为为lOOng/mL，将凝胶置于37°C水浴中解育15天后流变学测试，发现 凝胶的储能模量G'均降低至加入基质金属蛋白酶-Π 之前的l/^2左右，如图5所示。说明水凝 胶逐渐被基质金属蛋白酶-II降解。将降解后凝胶W基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 表征，结果显示有预期的分子片段生成，证明了降解过程的发生，如图1所示。对降解后的凝 胶进行原子力显微镜扫描，结果显示，凝胶中纤维减少，证明了降解过程的发生，如图6所 /J、- 〇
[0045] 实施例2:
[0046] Ac-IsSLKGQ-N出凝胶的制备方法：
[0047] 选取前述固相合成法制备的短肤Ac-IsSLKGQ-N此在化pes缓冲液的作用下，稀释为 浓度为8mM，震荡超声后，置于85°C水浴中加热2小时，自然冷却至室溫，加入溶解在胎pes缓 冲液中并含有5mM CaCb和2mM二硫苏糖醇(DTT)的谷氨酷胺转氨酶，使酶最终作用浓度为 0.9U/mL，短肤最终浓度为7.27mM。将所得溶液置于37 °C水浴中解育24小时，可得到能够倒 立自支撑的水凝胶。
[0048] 对实施例2中的凝胶进行测定：
[0049] 吸取20yLAc-l3SLKGQ-N出凝胶，滴加于洗净的娃片上，之后迅速加入300化超纯水， 静置吸附10s后，氮气吹干样品，AFM扫描，发现形成凝胶后，纳米纤维的结构保持不变，如图 2所示。吸取lOiiL多肤溶液滴加在微栅表面，吸附6s后吸去表面液体，迅速浸没入液态乙烧 中，冷冻5min后保存于液氮中，之后使用透射电子显微镜观察。结果显示，通过透射电子显 微镜观察到多肤样品在化pes缓冲溶液中为纤维结构，与原子力显微镜观察到的一致，如图 3所示。
[(K)加]在Ac-IsSLKGQ-N此凝胶形成24小时后，在水凝胶上方加入NIH-3T3细胞，在37Γ， 5%C02环境中培养15天后，显微镜观察显示，NIH-3T3细胞部分进内部，为人造组织的研发 提供了实验思路。
[0化1]实施例3:
[0052]采用哈克流变仪表征Ac-IsSLKGQ-N此水凝胶样品的机械性能(粘弹性），采用直径 为35mm锥度为2°的锥板为转子，采用35mm直径的平板为定子，每次测量使用样品体积为400 yL，实验溫度恒定为25°C，WIHz频率进行应力扫描，扫描范围为0.01 %至100%，测定凝胶 的线性粘弹区，从线性粘弹区中选取合适的应力进行动态频率扫描，扫描范围为o.omz至 lOOHz，研究储能模量G '和耗能模量G"之间的关系。
[0化3] 将Ac-IsSLKGQ-N出在化pes缓冲液作用下稀释至浓度为8mM，按照实施例2的方法加 入谷氨酷胺转氨酶，静置于37°C水浴24小时，然后取4(Κ)化在IHz频率作用下进行0.01%至 100%的应力扫描，实验结果如图4所示，水凝胶的储能模量G'约为800Pa。
[0054]采用本例中方法，测量加入lOOng/mL的基质金属蛋白酶-II并37°C解育15天后的 水凝胶，应力扫描结果显示其储能模量G'约为4001?左右，降低至加入基质金属蛋白酶-II 前的一半。
[0化5] 实施例4:
[0056] 按照实施例2中的方法制备Ac-IsSLKGQ-N出水凝胶，并向其中加入10化g/mL终浓度 的基质金属蛋白酶-II，37°C解育15天后，吸取20yLAc-l3SLKGQ-N出凝胶，滴加于洗净的娃片 上，之后迅速加入3(Κ)化超纯水，静置吸附10s后，氮气吹干样品，AFM扫描，发现经过基质金 属蛋白酶-Π 降解后，纳米纤维的结构被破坏，如图6所示。
[0057] 需要说明的是，在本说明书的教导下，本领域技术人员所做出的任何等同方式，或 明显变型方式均应在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种多肽，其特征在于，所述的多肽的其氨基酸序列为SEQ ID N0:1。2. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的N端进行了乙酰化，C端进行氨 基化。3. 权利要求1或2所述的多肽在制备水凝胶中的应用。4. 一种水凝胶，其特征在于，所述的水凝胶是将权利要求2所述的多肽在pH为7~8的缓 冲溶液中加热并冷却，然后加入谷氨酰胺转氨酶，37°C孵育后形成水凝胶。5. 如权利要求4所述的水凝胶，其特征在于，所述的缓冲溶液为Hepes溶液。6. 如权利要求4所述的水凝胶，其特征在于，所述的谷氨酰胺转氨酶加入浓度为0.1~ 20U/mL〇7. 如权利要求4所述的水凝胶，其特征在于，所述的多肽的添加浓度为4-32mM。8. 权利要求4所述的水凝胶在制备细胞培养支架中的应用。9. 一种降解权利要求4所述的水凝胶的方法，其特征在于，是用基质金属蛋白酶-II来 降解。10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的基质金属蛋白酶-II的使用浓度为25 ~500ng/mL〇
【专利摘要】本发明提供一种制备水凝胶的多肽，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO:1；本发明的多肽用于制备水凝胶；制备的水凝胶可用于制备细胞培养支架。本发明的多肽在生理条件下，利用生物体自身的酶进行催化，形成水凝胶，避免了外加化学剂、紫外光等对组织的伤害。且可利用生物酶进行降解，实现了通过生物体内源性物质对凝胶的降解，避免了引入外源化学剂造成的潜在毒性和免疫原性风险；是一类较为理想的组织工程材料，对人类生命健康具有重要意义。
【IPC分类】C07K7/06, C12N5/00
【公开号】CN105669832
【申请号】CN201610165810
【发明人】陈翠霞, 徐海, 张宇
【申请人】中国石油大学(华东)
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月22日