一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类种质构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于海水鱼类遗传育种技术领域，具体设及一种通过基因组编辑构建海水 解鱼棠鱼类新种质的方法，即对半滑舌錦等海水解蝶鱼类基因组中特定基因进行定点突变并 培育为成鱼的方法。
【背景技术】
[0002] 基因组编辑技术，是最近几年发展起来的对基因组进行定点修饰的一种基因操作 技术，可W对基因组中的任何基因或序列进行定点敲除或将外源基因引入基因组中的特定 位点。基因组编辑主要包括TALEN技术和CRISPR/Cas9技术。基因组编辑技术在海水鱼类基 因功能分析和基因工程育种方面具有重大意义和应用价值，开展海水解蝶鱼类基因组编辑 技术的研究，对于分析基因功能及培育定点突变的海水解蝶鱼类优良种质至关重要。但迄 今国内外未见有关海水解蝶鱼类基因组编辑技术的研究报道，运也成为限制基因组编辑技 术在海水解蝶鱼类基因功能分析和基因定点突变育种中成功应用的瓶颈因子。
[0003] 半滑舌錦(切noglossys semilaevis)是一种近海溫水性大型底栖鱼类，其肉质鲜 美、营养丰富，深受消费者喜爱，是我国海水养殖鱼类的主导品种之一。但半滑舌錦雌、雄个 体生长速度差异很大，雌性比雄性生长快2-4倍。由于雄性个体小、生长缓慢等原因，增加了 半滑舌錦的养殖成本、降低了养殖产量，严重影响了半滑舌錦苗种的推广及养殖产业的发 展。开展半滑舌錦雌雄特异基因的筛选鉴定及其功能的分析是掲示半滑舌錦性别决定机 审IJ、探索雌雄生长差异的分子机理、建立性别控制技术的重要任务。我们最近的研究表明 DMRT1基因是半滑舌錦Z染色体连锁、精巢特异表达的雄性决定基因，该基因表达就是生理 雄鱼，表现为个体小、生长慢，而该基因不表达就是生理雌鱼，表现为生长快、个体大。而有 关该基因敲除（突变)是否会对性腺发育、生理性别及鱼体大小产生影响，目前国内外均未 见报道。因此，建立半滑舌錦基因组编辑技术、进行DMRT1基因定点敲除研究，对于建立海水 解蝶鱼类基因功能分析方法、研制基因定点突变海水解蝶鱼类新种质具有重要意义和应用 价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种基于基因组编辑的海水解蝶鱼类新种质构建方法，即通 过将某一基因定点突变后构建海水解蝶鱼类突变体的方法，从而解决目前海水解蝶鱼类缺 乏基因组编辑技术，难W通过基因组编辑培育新种质的问题。
[0005] 本发明的构建海水解蝶鱼类突变体的方法，其具体步骤如下
[0006] 1)基因组编辑TALEN质粒的构建：
[0007] 在基因序列为SEQ ID NO: 1的半滑舌錦Dmdl基因的外显子1编码区起始密码子 ATG下游80-140个核巧酸的区间选取一对TALEN结合位点，每个结合位点的长度为16-18bp 核巧酸，左右结合位点之间相隔15-17bp，结合位点序列5/端的起始碱基的上游碱基为T;构 建Dmrt 1基因的TALEN基因组编辑质粒；
[000引2)基因组编辑质粒的体外转录：
[0009] 将步骤1)构建的Dmrtl基因组编辑TALEN质粒转化大肠杆菌后进行培养，然后将基 因组编辑TALEN质粒提取出来;用限制性内切酶NotI酶切基因组编辑质粒，使其线性化;体 外转录成相应的mRNA，并进行纯化；
[0010] 3)体外转录的mRNA向海水解蝶鱼类受精卵的转移及受精卵培养：
[0011] 将纯化好的TALEN mRNA浓度调为90-1 lOng/μΙ;将TALEN mRNA转入解蝶鱼类受精 卵的动物极中，随后将受精卵放入恒定溫度的装有无菌海水的烧杯中进行培养；
[0012] 所述的受精卵为处于1-4细胞期的受精卵；
[0013] 所述的恒定溫度，其中半滑舌錦为22°C-23°C，牙解为14°C-16°C，大菱解为12°C- 13。。
[0014] 4)基因发生定点突变鱼苗的养殖与检测方法；
[0015] 将解化中的受精卵转移到装有海水的30k50L的玻璃钢养殖缸中培养，在0.化/ min-化/min的充气量和22°C-23°C的水溫下，经过37.5-41.化的解化后鱼苗出膜；出膜后3 天鱼苗开口摄食，此时投喂轮虫；12天后投喂面虫无节幼体;50天后投喂面虫成体和配合饲 料；
[0016] 待鱼苗长到5-7厘米时，剪其罐条放入95%酒精中保存，采用常规的酪氯仿方法进 行罐条DNA的提取，将提取的DNA用作PCR模板，在目的基因祀位点两端设计PCR引物，进行 PCR扩增，做单克隆测序，与野生型目的基因序列比较筛选出目的基因祀位点敲除的鱼苗；
[0017] 本发明还提供一种培育基因发生定点突变的海水解蝶鱼类新种质的方法，是将上 述方法筛选出的基因定点突变的F0代鱼与野生型鱼进行杂交，得到杂交子代鱼，然后剪取 杂交子代鱼的罐条提取DNA，做PCR测序，根据目的基因测序结果得出基因定点突变F0代鱼 的可遗传突变类型，再W检测出可遗传突变类型的F0代鱼作为父、母本，进行人工繁殖获得 F1代鱼，再WF1代鱼罐条提取的DNA作为模板进行PCR测序，从中筛选出基因双位点突变的 F1代鱼，将筛选出的F1代鱼作为父、母本，进行人工繁殖后即可获得纯合突变体系F2代鱼。
[0018] 本发明可使解蝶鱼类目的基因发生定点突变，有效敲除目的基因，为解蝶鱼类基 因功能研究和新种质创制提供了一种新的方法;解决了解蝶鱼类显微注射的胚胎难W养成 的难题，为解蝶鱼类基因组编辑育种提供了有效的技术手段。
【附图说明】
[0019] 图1:半滑舌錦DMRT1基因5/端不翻译区和外显子1、内含子1序列及TALEN结合位点 序列（字母大写为外显子1，加粗AT日为起始密码子，TALEN1L为左边结合位点，TALEN1R为右 边结合位点）；
[0020] 图2:半滑舌錦DMRT1基因 TALEN-1L质粒核屯、原件示意图；
[0021] 图3:半滑舌錦DMRT1基因 TALEN-1R质粒核屯、原件示意图；
[0022] 图4:dmrtl-TALEN-lL与祀位点结合的蛋白模块序列图，其中大写字母为蛋白模块 的蛋白序列，其中阴影部分为dmrtl-lL TALEN r邱eats,编码578个氨基酸，识别dmrtl外显 子1上的左边17个特异核巧酸序列（CCCGCTGCAGGAACCAC);下划线显示为C-terminal TAL effector and i^kl cleavage domain,中括号标识为N-terminal effector。矩形方框内 显示为SP6启动子，加粗显示为Notl酶切位点；
[0023] 图5:dmrtl-TALEN-lR与祀位点结合的蛋白模块序列图，其中大写字母为蛋白模块 的蛋白序列，其中阴影部分为dmrtl-lR TALEN r邱eats,编码578个氨基酸，识别dmrtl外显 子1上的右边17个特异核巧酸序列(AGCGTTTGTGGCCC TTC);下划线显示为C-terminal TAL effector and i^kl cleavage domain,中括号标识为N-terminal effector。矩形方框内 显示为SP6启动子，加粗显示为Notl酶切位点；
[0024] 图6:Dmrtl基因敲除错配酶检测结果图；
[0025] 图7:10尾半滑舌錦Dmrtl可能的突变类型图；
[0026] 图8:Dmrtl基因定点突变半滑舌錦遗传雄性鱼苗性腺结构图TALEN敲 除雄鱼性腺切片(4倍）；2.Dmrtl TALEN敲除雄鱼性腺切片(20倍）；3.正常雌鱼性腺切片;4. 正常雄鱼性腺切片）
[0027] 图9:Dmdl基因敲除半滑舌錦遗传雄性鱼苗性别相关基因的表达图(A:切pl9a的 表达模式；8:〇111的1的表达模式；(：^〇別2的表达模式；0:4(3*111参照^6111日16:1-3为正常雌 鱼;Dmrt ko: 4为Dmrtl基因突变雄鱼;Male: 5-7为正常雄鱼）
[0028] 图10 :Dmrtl基因定点突变半滑舌錦遗传雄鱼与正常雄鱼大小比较图（A:正常雌 鱼;B:正常雄鱼;C: Dmrt 1基因定点突变的雄鱼）。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0030] 实施例1、半滑舌錦Dmrtl基因组编辑TALEN质粒的构建：
[0031] 1.基因组编辑TALEN质粒的构建方法：
[0032] 根据半滑舌錦Dmrtl基因的基因组序列SEQ ID NO: 1，在外显子1编码区起始密码 子ATG下游80-140个核巧酸的区间选取一对TALEN结合位点，每个结合位点的长度为16- 1 8 b P核巧酸，左右结合位点之间相隔1 5 - 1 7 b P，左边结合位点的序列为5'- CCCGCTGCAGGAACCAC-3'（SEQ ID N0:4);右边结合位点的序列为5'-AGCGTTTGTGGCCCTTC-3' (SEQ ID N0:5);结合位点序列5/端起始碱基的上游碱基应该为T。
[0033] 构建TALEN质粒的主要步骤为：首先按照选定的17个碱基的TALEN结合位点序列 (图1)，利用Addgene公司的试剂盒TALEN Golden Gate toolkit中4种重复可变双氨基酸残 基位点（RVD)质粒模块(可分别识别4、1\6、〇，选择分别识别结合位点1-10个碱基的10个 RVD质粒模块与试剂盒中的P即S_A质粒经Bsal酶切后连接为P即S_A重组质粒，选择分别识 别第11-16个碱基的6个RVD模块质粒与试剂盒中的pFUS_Bn质粒经Bsal酶切后连接为pWS_ 化重组质粒，测序验证后的两种重组质粒再与试剂盒中的pCS2-TALEN-ELD、pCS2-TALEN- KKR、识别最后一个碱基的RVD模块质粒一起经Esp3I酶切连接，即构建为最终的dmdl- TALEN-1L或dmd 1-TALEN-1R质粒（如图 2