-图 5)，其中 dmd 1-TALEN-1L和dmd 1-TALEN-1R的 序列分别为SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3(图4和图5)。采用此种方法构建的TALEN质粒经验 证有90 %的克隆序列正确。运样设计构建的TALEN基因组编辑质粒具有高的突变效率，而脱 祀率较低。
[0034] 2.Dmrtl TALEN质粒的扩培
[00巧](1)将Dmrtl TALEN质粒与感受态细胞轻轻混匀，然后在冰上放置40min。
[0036] (2)将Dmrtl TALEN质粒和感受态细胞的混合物放置于42°C水中，进行90秒热击， 然后立即放置于冰上冷却2分钟。
[0037] (3)加入ImL LB液体培养基，放到37°C摇床里，培养化，转速为15化pm。
[0038] (4)取10化L菌液涂布于含有Amp的LB平板上。
[0039] (5)将平板放置于37Γ培养箱中培养12-1化，待长出单克隆菌落后接种到1ml的LB 液体培养基中，过夜培养。
[0040] (6)将过夜培养的菌液接种至100ml的LB培养基中，培养12h。
[0041] (7)将培养后的菌液离屯、去上清，收集沉淀。
[0042] (8)用质粒提取试剂盒(天根)提取质粒，并测定质粒浓度。
[0043] (9)利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒，看大小是否是Dmrtl TALEN质粒的大小，看是 否是两条或Ξ条电泳条带。
[0044] 3.Dmrtl TALEN菌种保存。取6个离屯、管，每个离屯、管装入上一步骤中第6小步骤过 夜培养的菌液500ul，再分别加入500ul 50%灭菌甘油；先-20°C保存4h，再转移至-80°C保 存。
[0045] 4.Dmrtl TALEN质粒保存于-20°C。
[0046] 实施例2、基因组编辑质粒的体外转录：
[0047] 将基因组编辑(TALEN)质粒转化大肠杆菌后进行培养，采用质粒提取试剂盒将基 因组编辑质粒提取出来;用相应的限制性内切酶Notl酶切基因组编辑质粒，使其线性化;采 用商业来源的体外转录试剂盒将线性化的质粒转录成相应的mRNA，并进行纯化。
[0048] 下面W半滑舌錦Dmrtl基因组编辑(TALEN)质粒的体外转录为例进行详细说明。
[0049] -)体外转录所需的Dmrtl TALEN质粒通过两种方式获取。
[0050] ( -)-80°C下保存的半滑舌錦Dmrtl TALEN菌种扩大培养
[0051 ] 1.将-80°C下保存的菌种从超低溫冰箱取出来，解冻后接种至100ml的LB培养基 中，培养12h。
[0052] 2.将培养的菌液离屯、去上清，收集沉淀。
[0053] 3.本实施例用质粒提取试剂盒(天根)提取质粒，并测定质粒浓度。
[0054] 4.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒，看大小是否是Dmrtl TALEN质粒的大小，看是否 是两条或Ξ条电泳条带。
[0055] (二)Dmrtl TALEN质粒转化大肠杆菌扩大培养
[0056] 1.将Dmrtl TALEN质粒与感受态细胞轻轻混匀，然后在冰上放置40min。
[0057] 2.将Dmrtl TALEN质粒和感受态细胞的混合物放置于42°C水中，进行90秒热击，然 后立即放置于冰上冷却2分钟。
[0化引 3.加入ImL LB液体培养基，放到37Γ摇床里，培养化，转速为15化pm。
[0059] 4.取10化L菌液涂布于含有Amp的LB平板上。
[0060] 5.将平板放置于37Γ培养箱中培养12-1化，待长出单克隆菌落后接种到1ml的LB 液体培养基中，过夜培养。
[0061] 6.将过夜培养的菌液接种至100ml的LB培养基中，培养12h。
[0062] 7.将培养后的菌液离屯、去上清，收集沉淀。
[0063] 8.用质粒提取试剂盒(天根)提取质粒，并测定质粒浓度。
[0064] 9.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒，看大小是否是Dmrtl TALEN质粒的大小，看是否 是两条或Ξ条电泳条带。
[0065] 二)Dmrtl TALEN质粒的体外转录
[0066] 1.根据测定的质粒的浓度，取适量的质粒，使其达到lug。
[0067] 2.用限制性内切酶Notl酶切质粒，使其线性化。
[006引酶切反应体系：
[0069]
[0070] 反应溫度:37°C
[0071] 反应时间：2-3h
[0072] 3.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒是否被切开。如果酶切后的质粒比原质粒的bp数 少，说明已切开;否则没有切开，可W继续酶切。
[0073] 4.用mlESSAGEmMACHINE饭试剂盒把线性化的质粒体外转录成mRNA。
[0074] 5.体外转录成的mRNA必须经过纯化才能进行显微注射，本实施例用的是Sigma体 外转录纯化试剂盒。
[0075] 6.用琼脂糖凝胶电泳检测体外转录的mRNA的质量如何。
[0076] 7 .测定体外转录的mRNA的浓度，根据浓度把Dmdl TALEN的左右臂mRNA都调整为 200ug/ul，然后等体积混合。
[0077] 8.-20°C或-80°C下保存DmパlTALENmRNA。
[0078] 实施例3、体外转录的mRNA向海水解蝶鱼类受精卵的转移及受精卵培养
[0079] 将纯化好的TALEN mRNA浓度调为90-110ng/ul;收集发育正常的处于1-4细胞期的 解鱼棠鱼类受精卵;采用常规方法将100-30化g的TALEN mRNA转入受精卵的动物极中，随后将 受精卵放入恒定溫度(半滑舌錦为22°C-23°C，牙解为14°C-16°C，大菱解为12°C-13°C)下装 有无菌海水的烧杯中进行培养，并且向烧杯中加入lOOOOx的1%亚甲基蓝溶液(每100ml无 菌海水加入化1)，每3-化将存活的受精卵转入新的加亚甲基蓝的无菌海水中。本培养方法 比传统的解化池流水培养解化率提高5 % -10 %。
[0080] 下面W向半滑舌錦受精卵转移Dmrtl TALEN mRNA为例进行详细说明。
[0081 ] 一)Dmrtl TALEN mRNA向半滑舌錦受精卵转移
[0082] 1.将刚受精的卵进行消毒和漂洗，放入无菌海水，移至培育箱培养，溫度设定为22 Γ。
[0083] 2.将Dmdl TALEN mRNA准备好，解冻后12000巧m离屯、5min，放到4°C冰箱备用。
[0084] 3.40分钟后取少量受精卵在解剖镜下观察，直到观察到大部分受精卵动物极隆 起，开始准备TALEN mRNA转移。
[0085] 4.将发育正常的1-4细胞期的受精卵整齐排列在琼脂糖胶板的凹槽中，凹槽宽 0.9-lmm，深1mm。采用常规方法将100-3(K)pg的TALEN mRNA转入受精卵的动物极。
[0086] 二)受精卵的培养
[0087] 1.转移TALEN mRNA后的受精卵要及时放入装有22°C-23°C的无菌海水的500ml烧 杯的培养箱中进行培养，培育箱的溫度设定在22Γ。
[0088] 2.向无菌海水中加入亚甲基蓝溶液，每100ml无菌海水中加入化1 lOOOOx的1%亚 甲基蓝溶液(Ig亚甲基蓝溶于100ml灭菌水中）。
[0089] 3.每隔3-化换一次烧杯中的加亚甲基蓝溶液的无菌海水，并清除沉到杯底的死 卵。
[0090] 4.在培育箱中培养大概26-3化后，将50-300粒胚胎转移到体积为30-5化的玻璃钢 水槽中培养，水槽中装海水20-3化，水溫为22-23 °C。
[0091] 实施例4:基因发生定点突变鱼苗的养殖与检测；
[0092] 将解化中的受精卵转移到30k50L的养殖缸中培养，在0.化/min-3L/min的充气量 和22 °C-23 °C的水溫下，经过37.5-41.化解化后鱼苗出膜。出膜后3天鱼苗开口摄食，此时投 喂轮虫；12天后投喂面虫无节幼体;50天后投喂面虫成体和配合饲料。
[0093] 待鱼苗长到5-7厘米时，可W剪其罐条放入95%酒精中保存。采用常规的酪氯仿方 法进行罐条DNA的提取，将提取的DNA用作PCR模板，在目的基因祀位点两端设计特定PCR引 物，进行PCR扩增，做单克隆测序，与野生型目的基因序列比较筛选出目的基因祀位点敲除 的鱼苗。
[0094] 下面W半滑舌錦Dmrtl基因定点突变鱼苗的养殖与检测为例进行详细说明。一)半 滑舌錦Dmrtl基因定点突变鱼苗的养殖
[00M] 1.受精卵在培育箱中解化大概26-3化后，转移到体积为30L的圆形水槽中，解化 37.5-41.化后，鱼苗解化出膜。
[0096] 2.Ξ天后鱼苗开口，投喂小球藻和轮虫。轮虫投喂量为5-10个/ml,轮虫投喂时间 为3-22日龄，运期间投喂小球藻并且适时观察鱼缸里的轮虫数量，保证在约10个/ml左右。 10天后将鱼苗转移到新的养殖缸中进行养殖，转移过程中一定要仔细，动作不能太大W免 伤着鱼苗。
[0097] 3.当鱼苗出膜15天之后开始投喂面虫无节幼体，开始保持2个/ml,随着鱼苗长大， 数量也增多，但是轮虫的投喂量要逐渐减少直至伏底停止投喂，运期间要适时进行吸底和 倒缸工作，保证鱼苗在优良的水质环境下生长。
[0098] 4.鱼苗伏底后第5天，可将鱼苗轻轻转移到10化鱼缸中养殖。
[0099] 5.鱼苗伏底后开始驯化投喂150-250um粒径的配合饲料，面虫无节幼体投喂到50- 60天;小型面虫成体50-60天后与配合饲料并喂，运段期间每次鱼苗吃饱后都要及时把残巧 清除，W免影响水质。配合饲料的大小可根据鱼苗的大小灵活掌握。
[0100] 6.每隔7-15天，对鱼