一种液相制备阿托西班的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种液相制备阿托西班的方法。
技术背景
[0002]阿托西班(atosiban)是子宫内及蜕膜、胎膜上受体的环状肽催产素竞争性拮抗剂，在临床上使用其醋酸盐治疗早产。阿托西班可剂量相关性地抑制宫缩，并使环状肽催产素介导的前列腺素分泌减少，从而达到保胎的目的。醋酸阿托西班注射液(AtosibanAcetateInject1n)由辉凌公司(Ferring AB)研制，2000年3月首次在奥地利上市。
[0003]阿托西班是一条由9个氨基酸组成的环状多肽，肽链中包含3个非天然氨基酸D-Tyr(Et)、Mpa和Orn以及在Mpa与Cys之间形成的一对二硫键，C端为酰胺的形式，其结构式为:c[Mpa-D-Tyr(Et)-1Ie-Thr-Asn-Cys]-Pro-0rn-Gly-NH2。
[0004]关于阿托西班的制备方法，大多采用固相合成或固液结合:如美国专利US4504469采用Boc策略固相合成线性肽，用液氨切肽，再经液相氧化、纯化得醋酸阿托西班，操作复杂，不利于工业生产；国内专利CN200810043347.9XN200910008880.6均采用固相合成法，将氨基酸逐个连接到树脂上，再用树脂上碘氧化的方法形成二硫键，解决了空气液相氧化中溶解性差反应时间长的技术问题;CN201310411997.5先采用固相合成法合成线性肽，再使用I %TFA/DCM去除Cys(Trt)上的保护基Trt，接下来加氧化试剂固环得到环肽树脂，最后裂解得到阿托西班，解决了现有空气液相氧化带来大量废液，生产落后，效能不高以及碘作为氧化剂氧化的副产物多的技术问题;CN201010604790.6采用固相合成线性粗肽，再将线性阿托西班溶于乙腈水溶液中，用过氧化氢氧化法形成二硫键的方法进行阿托西班的合成，该方法解决了线性阿托西班难溶问题，最大可能的缩小了反应体积及减少了反应时间。
[0005]以上方法均需要使用多肽固相合成专用设备，而且大量的树脂和洗涤溶剂使得合成成本很高，不适宜大规模生产。
[0006]专利CN201310129543.9使用液相合成法合成五肽中间体H-1Ie-ThHBzD-Asn-CyMBzD-Pro-OH，进而实现阿托西班的液相合成，虽然解决了固相合成法设备复杂、成本高、不适宜大规模生产的问题，但是使用该中间体需要分3段合成线性肽，工序复杂，所用的苄基保护基Bzl需用氢解或液氮/钠处理除去，反应条件苛刻，而且在安全性方面存在隐患，对生产操作有较大的限制。
[0007]综上所述，从成本上来看，液相合成法比固相合成法成本低、更适宜大规模生产，但是使用苄基作为侧链保护基的液相合成法在操作难度上限制了生产操作，而且分3段合成线性肽工序复杂，因此，仍然需要找到一种工序简单、操作难度低的液相合成方法。
【发明内容】
[0008]本发明提供一种全液相合成方法，先分别合成片段四肽Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-1le-Thr(tBu)-0H 和片段五肽 Mfe-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Mfe,然后将两个片段相连接、裂解除去侧链保护基得到阿托西班线性粗肽，再进行液相氧化、纯化、冻干得到阿托西班。
[0009 ]为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0010]—种液相制备阿托西班的方法，包括以下步骤:
[0011](1)、!^811-0!1和三氟乙酸酐反应制备了€3-4811-0!1;
[0012](2)、液相条件下，Tfa-Asn-OH和H-Cys(Trt)-0H、H-Pro-0H、H-0rn(Boc)-0H、H-Gly_NH2 依次偶联，合成片段 Tf a-Asn-Cy s (Trt)-Pro-Orn (Boc)-Gly_NH2，脱去 N端 Tf a 保护基，得五肽片段[5-9 ]: Mfe-Asn-Cys (Trt)-Pro-Orn (Boc)-GIy-Mfe ；
[0013](3)、液相条件下，Mpa(Trt)-OH 和 H-D-Tyr(Et)-0H、H-1le-0H、H-Thr(tBu)-0H 依次偶联，合成四肽片段[1-4]: Mpa (Trt)-D-Tyr (Et)-1 I e-Thr (tBu)-OH ；
[0014](4)、液相条件下四肽片段[1-4]和五肽片段[5-9]偶联得侧链保护基的全保护肽链:Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-1Ie-Thr(tBu)-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Mfe ；
[0015](5)、将步骤(4)中肽链经裂解、沉降、分离得阿托西班线性粗肽:Mpa-D-Tyr(Et)-1Ie-Thr-Asn-Cys-Pro-0rn-Gly-NH2 ；
[0016](6)、将步骤(5)中的粗肽经液相氧化、制备液相纯化、浓缩冻干后得阿托西班精肽:c[Mpa-D-Tyr(Et)-1Ie-Thr-Asn-Cys]-Pro-0rn-Gly-NH2。
[0017]上述步骤(I)中Tfa-Asn-OH的制备方法为:将H-Asn-OH溶解于三氟乙酸中，-10°C的条件下加入三氟乙酸酐，升温到10°c，搅拌30分钟，30°C减压浓缩，加入热甲苯，放置，过滤收集结晶，干燥后重结晶，即得Tf a-Asn-OH，其中H-Asn-OH和三氟乙酸酐的摩尔比为1:1?1.2。
[0018]上述步骤(2)中片段Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Mfe 的制备方法为:
[0019](2a)、Tfa-Asn-Cys(Trt)-OH的制备
[0020]将步骤(I)中制备的Tfa-Asn-OH和HOSu溶于有机溶剂中，加入DCC，室温反应，经过滤、浓缩、石油酿析晶得Tf a-Asn-OSu ；
[0021 ] 将Tfa-Asn-OSu加入H-Cys(Trt)-OH的碱性盐溶液中，TLC检测反应终点，调节溶液pH2?3，乙酸乙酯萃取，经浓缩、石油醚析晶、干燥、重结晶得Tfa-Asn-Cys (Trt)-OH;
[0022](2b)、Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-OH的制备
[0023]将步骤(2a)中制备的Tfa-Asn-Cys(Trt)-OH和HOSu溶于有机溶剂中，加入DCC，室温反应，经过滤、浓缩、石油醚析晶得Tfa-Asn-Cy s (Trt) -OSu ；
[0024]将Tfa-Asn-Cys(Trt)-OSu加入H-Pro-OH的碱性盐溶液中，TLC检测反应终点，调节溶液pH值2?3，乙酸乙酯萃取，经浓缩、石油醚析晶、干燥、重结晶得Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-OH；
[0025](2 c)、Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-OH的制备
[0026]将步骤(2b)中制备的Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-OH和HOSu溶于有机溶剂中，加入DCC，室温反应，经过滤、浓缩、石油醚析晶得Tf a-Asn-Cys (Trt)-Pro-OSu;
[0027]将Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-OSu 加入 H-Orn(Boc)-OH 的碱性盐溶液中，TLC 检测反应终点，调节溶液PH值至2?3，乙酸乙酯萃取，经浓缩、石油醚析晶、干燥、重结晶得Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-OH；
[0028](2d) 'Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Mfe的制备[0029 ]将步骤(2C)中制备的 Tfa-Asn-Cys (Trt) -Pro-Orn (Boc) -OH 和 HOSu 溶于有机溶剂中，加入DCC，室温反应，经过滤、浓缩、石油醚析晶得Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-OSu ；
[0030]将Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-OSu加入H-Gly_NH2.HCl的喊性盐溶液中，TLC检测反应终点，调节溶液pH值至2?3，乙酸乙酯萃取，经浓缩、石油醚析晶、干燥、重结晶得Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Mfe ；
[0031 ]其中反应步骤(2a)、(2b)、(2c)、(2d) *:Tfa-Asn-OH、Tfa-Asn-Cys(Trt)_OH、Tfa-Asn-Cy s (Trt)-Pro-OH、Tfa-Asn-Cy s (Trt)-Pro-Orn(Boc)-OH 分别与 HOSu 和 DCC 的摩尔比为1:1?I.1:1?I.I ；H-Cys(Trt)-OH^H-Pro-OH^H-Orn(Boc)-OH^H-Gly-NH2.HCl分别与碱性盐的摩尔比为1:1?2;Tfa-Asn-Osu与H-Cys(Trt)-OH、Tfa-Asn-Cys(Trt)-Osu与H-Pro-OH、Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Osu与H-Orn(Boc)-OH、Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Osu与H-Gly-NH2.HCl的摩尔比为 1:0.8?1.2。
[0032]上述步骤(2)中脱去N端Tfa保护基的方法为:将片段Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-NH2加入到IM的哌啶水溶液中溶解，搅拌反应20?24h，调溶液pH值至2?3，乙酸乙酯萃取，浓缩、石油醚析晶、干燥、重结晶得五肽片段[5-9] [NH2_Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-NH2Jo
[0033]上述步骤(3)中四肽片段[1-4][Mpa(Trt)-D-Tyr (Et)-1le-Thr(tBu)-OH]的制备方法为:
[0034](3a)、Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-OH的制备:
[0035]将Mpa (Trt) -OH和HOSu溶于有机溶剂中，加入DCC，室温反应，经过滤、浓缩、石油醚析晶得Mpa(Trt)-OSu；
[0036]将Mpa(Trt)-OSu加入H-D-Tyr(Et)-OH.HCl的碱性盐溶液中，TLC检测反应终点，调节溶液pH值至2?3，乙酸乙酯萃取，经浓缩、石油醚析晶、干燥、重结晶得Mpa (Trt) -D-Tyr(Et)-OH；
[0037](3b)、Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-1le-0H的制备:
[0038]将步骤(3a)中制备的Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-0H和HOSu溶于有机溶剂中，加入DCC，室温反应，经过滤、浓缩、石油醚析晶得Mpa (Trt) -D-Tyr (Et) -OSu ；
[0039