长斯托克斯位移色烯并喹啉染料及其在测序应用中的用途的制作方法

本公开涉及色烯并喹啉染料及其作为荧光标记的用途。具体地，这些化合物可以作为核苷酸标记用于核酸测序应用。

背景技术：

1、带有荧光标记的核酸的非放射性检测是分子生物学中的重要技术。在重组dna技术中采用的许多程序以前依赖于使用带有放射性标记的核苷酸或多核苷酸，例如32p。放射性化合物允许灵敏地检测核酸和其他感兴趣的分子。然而，在放射性同位素的使用中存在严重的局限性，诸如它们的费用、有限的保质期、不足的灵敏度和更重要的安全考虑因素。消除对放射性标记的需求同时降低了安全性风险以及与例如试剂处理相关的环境影响和成本。适合于非放射性荧光检测的方法包括以非限制性示例的方式进行的自动化dna测序、杂交方法、聚合酶链反应产物的实时检测和免疫测定。

2、对于许多应用而言，希望采用多个光谱可区分的荧光标记，以便实现对多个空间重叠分析物的独立检测。在此类多重方法中，可以减少反应容器的数量，从而简化实验方案并且促进专用试剂盒的生产。例如，在多色自动化dna测序系统中，多重荧光检测允许在单个电泳通道中分析多个核苷酸碱基，从而通过单色方法提高吞吐量，并且降低与通道间电泳迁移率变化相关的不确定性。

3、然而，多重荧光检测可能存在问题，并且存在的许多重要因素会限制适当荧光标记的选择。首先，在给定的应用中可能难以找到具有基本上分辨的吸收和发射光谱的染料化合物。另外，当若干荧光染料一起使用时，通过同时激发在可区分光谱区域中产生荧光信号可能是复杂的，因为这些染料的吸收带通常很分开，所以即使是两种染料也难以达到相当的荧光激发效率。许多激发方法使用高功率光源，如激光，因此染料必须具有足够的光稳定性以承受此类激发。对分子生物学方法特别重要的最后一个考虑因素是荧光染料必须与试剂化学组成(诸如dna合成溶剂和试剂、缓冲液、聚合酶和连接酶)相容的程度。

4、随着测序技术进展，还需要开发满足所有上述限制并且特别适用于高通量分子方法(诸如固相测序等)的另外的荧光染料化合物、其核酸缀合物和多个染料组。

5、具有改进的荧光特性(诸如合适的荧光强度、形状以及荧光带的波长最大值)的荧光染料分子可以提高核酸测序的速度和准确性。当在水基生物缓冲液中并且在较高温度下进行测量时，强荧光信号尤其重要，因为大多数有机染料的荧光强度在此类条件下显著较低。此外，染料所附接的碱基的性质也影响荧光最大值、荧光强度和染料的其他光谱特性。核碱基与荧光染料之间的序列特异性相互作用可以通过荧光染料的特异性设计来定制。荧光染料结构的优化可以提高核苷酸掺入的效率、降低测序误差的水平，并且减少核酸测序中试剂的使用，从而降低核酸测序的成本。

6、一些光学和技术的开发已引起图像质量的极大改善，但是最终受到光学分辨率差的限制。一般来讲，光学显微镜法的光学分辨率限于以所使用的光的波长的大约一半间隔开的对象。实际上，只有相距相当远(至少200nm至350nm)的对象才可以通过光学显微镜法分辨。提高图像分辨率并且增加每单位表面积的可分辨对象数量的一种方法是使用较短波长的激发光。例如，如果用相同的光学器件将光波长缩短δλ约100nm，则分辨率将更好(约δ50nm/(约15％))，将记录较少失真的图像，并且可识别区域上的对象的密度将增加约35％。

7、某些核酸测序方法采用激光来激发染料标记的核苷酸并对其进行检测。这些仪器使用较长波长的光，诸如红色激光，连同能够在660nm处激发的适当染料。为了在保持可用分辨率的同时检测更密集堆积的核酸测序簇，可以使用较短波长的蓝色光源(450nm至460nm)。在这种情况下，光学分辨率将不受较长波长红色荧光染料的发射波长的限制，而是受能够由次长波长光源(例如，由532nm处的“绿色激光”)激发的染料的发射的限制。因此，需要用于测序应用中的荧光检测的蓝色染料标记。

8、色烯并喹啉染料已在文献中报道用作荧光探针或线粒体标记。参见geng等人，sensors&actuators:b.chemical，2018年，第273卷：第1670-1675页，以及liu等人，chemical communications，2018年，第54卷第12期：第1509-1512页。然而，这些色烯并喹啉染料中的大多数具有红光发射并且它们在用于核苷酸测序的水性条件下的稳定性仍然未知。因此，设计具有定制的吸附波长和荧光斯托克斯位移、具有良好的稳定性的色烯并喹啉染料仍然是染料开发中的关键挑战。

技术实现思路

1、本文描述了适合于核苷酸标记和测序应用的具有长斯托克斯位移和改进的荧光强度和化学稳定性的色烯并喹啉染料。这些色烯并喹啉染料在蓝光和绿光激发下都具有强荧光(例如，这些色烯并喹啉染料可以具有约450nm至约530nm、约460nm至约520nm、约475nm至约510nm或约490nm至约500nm的吸收波长)。此外，与用于合成测序的市售染料相比，这些色烯并喹啉染料在高ph缓冲液中具有更高的稳定性。

2、本公开的一些方面涉及式(i)的化合物或其盐或内消旋形式：

3、

4、其中r1、r4、r5、r7、r8、r9、r10、r11、r12a和r12b中的每一者独立地是h、c1-c6烷基、经取代的c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c1-c6卤代烷基、c1-c6卤代烷氧基、(c1-c6烷氧基)c1-c6烷基、任选地取代的氨基、氨基(c1-c6烷基)、卤基、氰基、羟基、羟基(c1-c6烷基)、硝基、磺酰基、磺基、亚磺酸基、磺酸根、s-亚磺酰氨基或n-亚磺酰氨基；

5、r2和r3中的每一者独立地是h、c1-c6烷基或经取代的c1-c6烷基；并且

6、r6是c1-c6烷基或经取代的c1-c6烷基；

7、另选地，r1和r2连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的5元至10元杂环基；并且/或者

8、另选地，r3和r4连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的5元至10元杂环基；并且/或者

9、另选地，r8和r9连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的c6-c10芳基、任选地取代的3元至10元碳环基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的3元至10元杂环基。在一些实施方案中，当r2和r3中的每一者是乙基；r1、r4、r5、r7、r8、r10、r11、r12a和r12b中的每一者是h；并且r6是甲基时；则r9是包含羧基的经取代的c1-c6烷基。在一些实施方案中，当r1和r2连同它们所附接的原子一起形成哌啶基，并且r3和r4连同它们所附接的原子一起形成哌啶基时，使得该化合物具有以下结构r5、r7、r8、r10、r11、r12a和r12b中的每一者是h；并且r6是甲基时；则r9是包含羧基的经取代的c1-c6烷基。

10、在一些实施方案中，该式(i)的化合物也由式(ia)或其盐或内消旋形式表示：

11、

12、其中r13a、r13b、r14a和r14b中的每一者独立地是h、c1-c6烷基、经取代的c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c1-c6卤代烷基、c1-c6卤代烷氧基、(c1-c6烷氧基)c1-c6烷基、任选地取代的氨基、氨基(c1-c6烷基)、卤基、氰基、羟基、羟基(c1-c6烷基)、硝基、磺酰基、磺基、亚磺酸基、磺酸根、s-亚磺酰氨基或n-亚磺酰氨基；并且由实线和虚线表示的键选自由单键和双键组成的组，前提条件是当是双键时，则r14b不存在。

13、在式(i)或式(ia)的化合物的一些实施方案中，r6、r7、r8、r9、r10和r11中的一者包含羧基基团(-c(o)oh)。在其他实施方案中，r2或r3包含羧基基团。

14、在一些方面，本公开的化合物被如以下等底物部分标记或与该底物部分缀合：核苷、核苷酸、多核苷酸、多肽、碳水化合物、配体、颗粒、细胞、半固体表面(例如，凝胶)或固体表面。标记或缀合可经由羧基基团进行，该羧基基团可以使用本领域已知的方法与部分(如核苷酸)或结合到其上的连接基上的氨基或羟基基团进行反应以形成酰胺或酯。

15、本公开的一些其他方面涉及包含连接基基团的染料化合物，以实现例如与底物部分共价附接。可以在染料的任何位置处(包括在r基团中的任一者处)进行连接。在一些实施方案中，连接可经由r6、r7、r8、r9、r10和r11中的一者或经由式(i)的r2或r3进行。在一些另外的实施方案中，连接可经由r6、r7、r8、r9、r10和r11中的一者或经由式(ia)的r2进行。

16、本公开的一些其他方面提供由下式定义的标记的核苷或核苷酸化合物：

17、n-l-染料

18、其中n是核苷或核苷酸；

19、l是任选的连接基部分；并且

20、染料是根据本公开的式(i)或式(ia)的荧光化合物的部分，其中该式(i)或式(ia)的化合物的官能团(例如，羧基基团)与连接基部分或核苷/核苷酸的氨基或羟基基团进行反应以形成共价键合。

21、本公开的一些另外的方面涉及用式(i)或式(ia)的化合物标记的核苷酸或寡核苷酸。

22、本公开的一些另外的方面涉及一种试剂盒，该试剂盒包含可以用于各种免疫学测定、寡核苷酸或核酸标记或用于dna合成测序的染料化合物(游离或标记形式)。在又一方面，本公开提供了包含染料“组”的试剂盒，该染料“组”特别适合于在自动化仪器平台上的合成测序循环。在一些方面是包括一种或多种核苷酸的试剂盒，其中至少一种核苷酸是本文所述的标记的核苷酸。

23、本公开的另外的方面是一种确定靶多核苷酸的序列的方法，该方法包括：

24、(a)使引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物与一种或多种标记的核苷酸(例如，a、g、c和t或datp、dgtp、dctp和dttp)接触，其中所述标记的核苷酸中的至少一种标记的核苷酸是本文所述的用式(i)或式(ia)的色烯并喹啉染料标记的核苷酸，并且其中该引物多核苷酸与该靶多核苷酸的至少一部分互补；

25、(b)将标记的核苷酸掺入所述引物多核苷酸中以产生延伸的引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物；以及

26、(c)对所述延伸的引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物进行一个或多个荧光测量以确定所掺入的核苷酸的身份。