一种植物-细菌-真菌-鼠李糖脂联合修复石油污染土壤的方法与流程

本发明涉及一种利用植物-细菌-真菌-鼠李糖脂联合修复石油污染土壤的方法，属于生态方法修复石油污染土壤的技术领域。

背景技术：

80年代以前，治理石油烃污染土壤还仅限于物理和化学方法，即热处理和化学浸出法。热处理法是通过焚烧或煅烧，可净化土壤中大部分有机污染物，但同时亦破坏土壤结构和组分，且价格昂贵而很难实施。化学浸出和水洗也可以获得较好的除油效果，但所用的化学试剂的二次污染问题限制了其应用。80年代以来，污染土壤的生物修复技术越来越引起人们的关注。生物修复是利用生物的生命代谢活动减少土壤环境中有毒有害物的浓度，使污染土壤恢复到健康状态的过程。

生物修复技术是在生物降解的基础上发展起来的一种新兴的清洁技术，它是传统的生物处理方法的发展。与物理、化学修复污染土壤技术相比，它具有成本低，不破坏植物生长所需要的土壤环境，污染物氧化安全，无二次污染，处理效果好，操作简单等特点。生物修复可通过环境因素的最优化而加速自然生物降解速率，是一种高效、经济和生态可承受的清洁技术。

目前，治理石油烃类污染土壤的生物修复技术主要有两类:一类是微生物修复技术，按修复的地点又可分为原位生物修复和异位生物修复；另一类是植物修复法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用植物-细菌-真菌-鼠李糖脂联合修复石油污染土壤的方法，对石油污染土壤进行修复，从而达到恢复地方土壤自然生态环境。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种植物-细菌-真菌-鼠李糖脂联合修复石油污染土壤的方法，包括如下步骤：

1)清除石油污染土壤表面的杂质；

2)将复合微生物菌剂与地表至10～20cm深的石油污染土壤混合均匀后，均匀喷洒鼠李糖脂溶液；

3)播种狗牙根种子，覆土1～2cm。

进一步的，上述的方法，所述复合微生物菌剂包括枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、粪链球菌和热带假丝酵母。

进一步的，上述的方法，所述复合微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：

1)将枯草芽孢杆菌在lb培养基中培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

2)将荧光假单胞菌在牛肉膏蛋白胨培养基中培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

3)将粪链球菌在mrs培养基中培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

4)将热带假丝酵母在yepd培养基中培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

5)将培养后的枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、粪链球菌和热带假丝酵母按体积比1:1:1:1进行混合，得混合菌；

6)将混合菌接种于载体上，于25℃恒温箱培养48小时，得复合微生物菌剂；所述载体由腐植酸和诺沃肥按重量比1:1混合制得；按质量比，混合菌:载体＝1:2.5。

进一步的，上述的方法，所述lb培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，蒸馏水1l，ph＝7.5，121℃灭菌20min。

进一步的，上述的方法，所述牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1l，ph＝7.2～7.4，121℃灭菌20min。

进一步的，上述的方法，所述mrs培养基的组成为：酪蛋白10g，牛肉膏10g，酵母浸出汁5g，葡萄糖5g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，tween-801ml，mgso4·7h2o0.2g，蒸馏水1l。

进一步的，上述的方法，所述yepd培养基的组成为：酵母粉1g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1l，ph＝6.0，115℃湿热灭菌20min。

进一步的，上述的方法，所述复合微生物菌剂的施撒量为2～3kg/m²。

进一步的，上述的方法，所述鼠李糖脂的制备方法包括如下步骤：

1)将铜绿假单胞杆菌接种于斜面培养基上，放入振荡培养箱中，37℃，转速250r/min下震荡培养24后，于110～115℃灭菌30min，得种子培养液；所述斜面培养基组成为：葡萄糖4g，蛋白胨5g，nacl5g，蒸馏水1l，ph＝7～7.2，121～126℃灭菌30min；

2)将种子培养液按体积百分比5％的接种量接种于发酵培养基中，放入振荡培养箱中，37℃，转速250r/min下发酵56h，调节所得发酵液的ph至8，再将发酵液在转速为8000r/min、温度为4℃的条件下离心20min除去菌体，离心后，将上清液的ph调至2以下，放入4℃的冰箱中静置12h，再用体积比为2:1的氯仿/甲醇萃取液等体积萃取上清液，静置分层后，取下层；将中层再萃取，静置使白色沉淀层压缩，再取下层，合并下层萃取液，置于旋转蒸发器中，在真空度为0.05mpa～0.07mpa、温度为40℃的条件下蒸干溶剂，得到鼠李糖脂。

所述发酵培养基组成为：玉米油80g，kh2po44g，k2hpo46g，nano33g，nacl1.1g，kcl1.1g，mgso4·7h2o0.2g，无水cacl20.02g，蒸馏水1l，ph＝7。

进一步的，上述的方法，所述鼠李糖脂溶液的浓度为4g/l；鼠李糖脂溶液的施撒量为1l/m²～1.5l/m²。

本发明的有益效果是：

1、本发明中，植物狗牙根，生命力强，不怕践踏，繁殖迅速，蔓延快，成片生长生物量大，可自播，适应粗放型种植和管理，经济成本较低，是供试植物中最具修复石油污染的植物。

2、本发明中，枯草芽孢杆菌为运动的、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，能产生脂肽类表面活性剂，可以转化和降解石油的芳烃、烷烃和沥青质组分以及极性有机硫化合物和有机氯化合物，同时可以降低原油的重质馏分含量，改善原油的物理化学性质。荧光假单胞菌为好氧革兰氏阴性菌，对原油有乳化、降解作用，在生长过程中分解少量原油，产生的鼠李糖脂表面活性剂、有机酸及气体等代谢产物均可影响原油的物理化学性质。粪链球菌为兼性厌氧革兰氏阳性球菌，能产生胞外蛋白，可在体外分解多环芳烃，当其与好氧细菌混合使用时，能达到更好的修复效果。热带假丝酵母能够利用正烷烃作为单一碳源快速生长，而且有研究表明热带假丝酵母产生的菌丝可以使土壤中其他菌种更自由地移动，使得它们与土壤接触更充分从而提高对石油烃类物质的降解能力。

3、本发明，鼠李糖脂是一类非常重要的生物表面活性剂，不仅具有乳化、增溶、降低表/界面张力等功能，而且毒性小、易于生物降解。

附图说明

图1为原始土壤中石油烃含量。

图2为本发明与对照例修复石油污染土壤60天后，石油烃浓度检测结果对照柱状图。

图3为本发明与对照例修复石油污染土壤60天后，石油烃降解率对照柱状图。

具体实施方式

一种植物-细菌-真菌-鼠李糖脂联合修复石油污染土壤的方法，包括如下步骤：

(一)清除石油污染土壤表面的杂质；

(二)复合微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：

1)将枯草芽孢杆菌在lb培养基中培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

所述lb培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，蒸馏水1l，ph＝7.5，121℃灭菌20min。

2)将荧光假单胞菌在牛肉膏蛋白胨培养基中培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

所述牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1l，ph＝7.2～7.4，121℃灭菌20min。

3)将粪链球菌在mrs培养基中培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

所述mrs培养基的组成为：酪蛋白10g，牛肉膏10g，酵母浸出汁5g，葡萄糖5g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，tween-801ml，mgso4·7h2o0.2g，蒸馏水1l。

4)将热带假丝酵母在yepd培养基中培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

所述yepd培养基的组成为：酵母粉1g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1l，ph＝6.0，115℃灭菌20min。

5)将培养后的枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、粪链球菌和热带假丝酵母按体积比1:1:1:1进行混合，得混合菌；

6)将混合菌接种于载体上，于25℃恒温箱培养48小时，得复合微生物菌剂；所述载体由腐植酸和诺沃肥按重量比1:1混合制得。按质量比，混合菌:载体＝1:2.5。

(三)鼠李糖脂溶液的制备

1)将铜绿假单胞杆菌接种于斜面培养基上，放入振荡培养箱中，37℃，转速250r/min下震荡培养24后，于110～115℃灭菌30min，得种子培养液；所述斜面培养基组成为：葡萄糖4g，蛋白胨5g，nacl5g，蒸馏水1l，ph＝7～7.2，121～126℃灭菌30min；

2)将步骤1)所得种子培养液按体积百分比5％的接种量接种于发酵培养基中，放入振荡培养箱中，37℃，转速250r/min下发酵56h，调节所得发酵液的ph至8，再将发酵液在转速为8000r/min、温度为4℃的条件下离心20min除去菌体，离心后，将上清液的ph调至2以下，放入4℃的冰箱中静置12h，再用体积比为2:1的氯仿/甲醇萃取液等体积萃取上清液，静置分层后，取下层；将中层再萃取，静置使白色沉淀层压缩，再取下层，合并下层萃取液，置于旋转蒸发器中，在真空度为0.05mpa～0.07mpa、温度为40℃的条件下蒸干溶剂，得到鼠李糖脂。

所述发酵培养基组成为：玉米油80g，kh2po44g，k2hpo46g，nano33g，nacl1.1g，kcl1.1g，mgso4·7h2o0.2g，无水cacl20.02g，蒸馏水1l，ph＝7。

将鼠李糖脂溶解于蒸馏水中，制成浓度为4g/l的鼠李糖脂溶液。

(四)将复合微生物菌剂均匀施撒于石油污染土壤上，并与地表至10～20cm深的石油污染土壤混合均匀后，均匀喷洒鼠李糖脂溶液。

复合微生物菌剂的施撒量为2～3kg/m²。

浓度为4g/l的鼠李糖脂溶液的施撒量为1l/m²～1.5l/m²。

(五)播种狗牙根种子，覆土1～2cm。

下面通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，此处所描述的实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

以丹东凤城市鸡冠山镇新开村轮胎裂解炼油厂的场地为试验地，如表1设置7个试验区域，每个试验区域划分2块，其中一块试验地采用本发明的方法，另一块试验地作为对照实验。

一、采用本发明的方法

一种植物-细菌-真菌-鼠李糖脂联合修复石油污染土壤的方法，包括如下步骤：

1、清除石油污染土壤表面的杂质；

2、复合微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：

1)将枯草芽孢杆菌在lb培养基中，在30℃，200r·min^-1下培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

所述lb培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，蒸馏水1l，ph＝7.5，121℃灭菌20min。

2)将荧光假单胞菌在牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃，200r·min^-1下培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

所述牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1l，ph＝7.2～7.4，121℃灭菌20min。

3)将粪链球菌在mrs培养基中，在30℃，200r·min^-1下培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

所述mrs培养基的组成为：酪蛋白10g，牛肉膏10g，酵母浸出汁5g，葡萄糖5g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，tween-801ml，mgso4·7h2o0.2g，蒸馏水1l。

4)将热带假丝酵母在yepd培养基中，在30℃，200r·min^-1下培养至菌落数大于1×10¹⁰cfu·ml^-1；

所述yepd培养基的组成为：酵母粉1g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1l，ph＝6.0，115℃灭菌20min。

5)将培养后的枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、粪链球菌和热带假丝酵母按体积比1:1:1:1进行混合，得混合菌；

6)将混合菌接种于载体上，于25℃恒温箱培养48小时，得复合微生物菌剂；所述载体由腐植酸和诺沃肥按重量比1:1混合制得。按质量比，混合菌:载体＝1:2.5。

3、鼠李糖脂溶液的制备

1)将铜绿假单胞杆菌接种于斜面培养基上，放入振荡培养箱中，37℃，转速250r/min下震荡培养24后，于110～115℃灭菌30min，得种子培养液；所述斜面培养基组成为：葡萄糖4g，蛋白胨5g，nacl5g，蒸馏水1l，ph＝7～7.2，121～126℃灭菌30min；

2)将所得种子培养液按体积百分比5％的接种量接种于发酵培养基中，放入振荡培养箱中，37℃，转速250r/min下发酵56h，调节所得发酵液的ph至8，再将发酵液在转速为8000r/min、温度为4℃的条件下离心20min除去菌体，离心后，将上清液的ph调至2以下，放入4℃的冰箱中静置12h，再用体积比为2:1的氯仿/甲醇萃取液等体积萃取上清液，静置分层后，取下层；将中层再萃取，静置使白色沉淀层压缩，再取下层，合并下层萃取液，置于旋转蒸发器中，在真空度为0.05mpa～0.07mpa、温度为40℃的条件下蒸干溶剂，得到鼠李糖脂。

所述发酵培养基组成为：玉米油80g，kh2po44g，k2hpo46g，nano33g，nacl1.1g，kcl1.1g，mgso4·7h2o0.2g，无水cacl20.02g，蒸馏水1l，ph＝7。

3)将鼠李糖脂配溶于蒸馏水中，制成浓度为4g/l的鼠李糖脂溶液。

4、将复合微生物菌剂均匀施撒于石油污染土壤上，并与地表至10～20cm深的石油污染土壤混合均匀后，均匀喷洒鼠李糖脂溶液。

复合微生物菌剂的施撒量为2～3kg/m²。

鼠李糖脂溶液的施撒量为1l/m²～1.5l/m²

5、播种狗牙根种子，覆土1～2cm。

为了保证狗牙根的生长，于土地施畜圈粪6-7kg/m²、过磷酸钙15-22.5g/m²作基肥。

二、采用对照例方法

方法同一，不同点在于对照例不施加鼠李糖脂溶液。

三、检测结果

表1采样及检测结果

1、在七个试验区域，在修复的第60天，在每个试验区域随机选取5个点取样，混合均匀后，采用顶空气相色谱法对七个试验区域中的两种方法修复的土壤中的石油烃浓度进行测定，对照结果如图2所示。由图2可以看出，修复60天后本发明各样品的石油烃浓度均比对照例低。

2、图3为本发明与对照例修复石油污染土壤60天后，石油烃降解率柱状图。由图3可以看出，本发明各样品的石油烃降解率均比对照例高。