微流体细胞装置及其使用方法与流程
相关申请的交叉引用
本申请在35u.s.c.§119(e)下要求来自于2018年1月11日提交的美国临时专利申请序列号62/616,126的优先权，该申请的全部内容通过引用合并在此。
提供了微流体装置，其尤其可用于根据尺寸和可变形性来浓缩细胞和/或分离细胞。
背景技术：
背景技术描述包括可用于理解本发明所述的系统和方法的信息。这不是承认本发明提供的任何信息是现有技术，或者任何具体或隐含引用的出版物是现有技术。
从患者获得的生物样品在相对大体积的流体中含有多种不同类型的细胞。通常，需要浓缩细胞、更换缓冲液或浓缩特定类型的细胞，以便进行各种生物学测定或以其它方式研究细胞。然而，目前用于进行这些类型的方法的技术通常依赖于重型设备如离心机，利用涉及透析或离子交换的耗时测定，需要多步骤复杂方法，或使细胞在下游生物测定中失去功能。另外，这些方法通常需要相对大的样品尺寸并且具有低的细胞回收率。
在一些情况下，样品可以含有多种细胞类型，包括但不限于红细胞、白细胞和各种其它细胞组分(例如，循环肿瘤细胞(ctc)、转移性细胞、正常细胞等)。分离特定的细胞类型，例如ctc可能是困难的，特别是当这些细胞相对于其它更丰富的细胞类型以低频率存在时。例如，据估计，每十亿个正常细胞或血细胞在血液样品中存在约一个ctc。
目前从血液样品中分离细胞群的方法可包括诸如荧光激活细胞分选、磁激活细胞分选或免疫磁性胶体分选的技术。这些方法费力，需要操作者专业知识，可能导致显著的细胞损失(差的回收率)和/或实施起来昂贵。分离细胞群的其它技术缺乏分离特异性，例如电荷流分离。需要快速和容易地浓缩细胞并基于大小分离细胞的新技术。
技术实现要素：
本发明公开了用于使用微流体装置操纵细胞的各种系统和方法。本技术允许快速浓缩细胞、基于大小或大小范围分离细胞、缓冲液更换、添加标记等，并且这些技术可以整合到其他工作流程中。本发明提供了更换缓冲液并实现高细胞恢复率的新技术。这些技术允许在细胞以低频率存在于溶液中时浓缩细胞，以及从大小不同的细胞的样品中分离特定大小或大小范围的细胞。例如，用于从样品中浓缩细胞的系统和方法可用于从血液样品中分离肿瘤细胞，而用于基于大小分离细胞的系统和方法可用于将活化的t细胞与非活化的t细胞分离。在一些方面，所述装置是可手动操作的。在其它方面，所述装置是自动化或部分自动化的。
在一个方面，提供了微流体装置，包括：用于引入包含细胞的溶液的输入机构；与所述输入机构流体连通的微流体腔室，其中，所述微流体腔室包括多排支柱，其中，每排包括沿着具有斜率的线分布的多个支柱，其中，相对于微流体腔室的侧面确定斜率；以及与微流体腔室流体连通的至少两个输出机构。通常，第一输出机构具有比第二输出机构大的横截面积。
还提供了用于经由输入机构将包含细胞的溶液引入微流体腔室的方法，其中，所述腔室与所述输入机构流体连通；施加压力以使细胞流过微流体腔室，其中，微流体腔室包括多排支柱，其中，每排包括沿着具有斜率的线分布的多个支柱，并且其中，相对于微流体腔室的侧面确定斜率；通过所述多排支柱将所述细胞偏转至所述腔室的一侧，以消耗从离开第一输出机构的溶液中的细胞，并富集离开第二输出机构的溶液中的细胞，其中，所述第二输出机构具有比所述第一输出机构更小的横截面积。
因此，在一个方面，施加压力以使细胞流过支柱矩阵并朝腔室的一侧侧向偏转，导致细胞浓度的局部增加。浓缩的细胞通过输出机构离开腔室，并被收集。在另一方面，施加压力以使细胞流动通过支柱矩阵，其中，大于截止尺寸的细胞被保留在路径中，而小于截止尺寸的细胞经由支柱之间的间隙进入相邻排。较大尺寸的细胞通过输出机构离开腔室并被收集；较小尺寸的细胞通过另一个输出机构离开腔室，并且也可以被收集。
本发明实施例的优点包括高通量、浓缩细胞的高产量、流速独立性、关于浓缩或分离不同大小的细胞的可配置性(通过改变支柱之间的间隙和/或每个支柱的斜度/旋转和/或每个支柱的形状/几何形状、支柱的旋转和支柱的间距)以及与手动或自动操作的兼容性。通常，在正常的层流条件下，微流体装置在细胞浓缩和细胞大小分离的情况下的性能与流量无关。在不同流速下，装置性能是相似的，但可能取决于鞘-样品(sheath-to-sample)的流速比。因此，细胞将侧向(laterally)地朝向腔室的一侧偏转，而与流体流过微流体装置的速率无关。另外的优点包括能够以低成本制造微流体装置。在一些实施方案中，包含细胞的溶液可被装载到注射器中，并且注射器可连接到微流体装置的输入机构。注射器的操作者手动按压柱塞(例如，手动注射)以使含有细胞的溶液流过装置。此外，本发明公开的实施方案不依赖于复杂的技术(例如，离心机、磁力等)来实现细胞浓缩。在一些实施方案中，微流体装置是一次性装置。在其它实施方案中，注射到微流体装置中的溶液体积范围为1ml至10ml或更多。
本主题的各种目的、特征、方面和优点将从以下优选实施例的详细描述中变得更加明显。
定义
本发明所用的术语“抗体”通常指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分或其片段，即含有免疫特异性结合抗原(例如，在细胞表面上)的抗原结合位点的分子。除非上下文另有说明，否则术语“抗体”包括但不限于抗体的所有同种型和亚型(例如iga、igd、ige、igg、igm等)、免疫球蛋白分子的任何类别(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类，以及其所有活性片段(具有免疫活性)。还应理解，任何重链(例如iga、igd、ige、igg、igm)可与任何轻链(例如κ或λ形式)配对。
抗体还包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、鼠抗体、缀合抗体(例如，与化疗剂、放射性核素、与另一种蛋白质等)、合成抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、单链抗体、由fab表达文库产生的抗体片段和由mrna展示或噬菌体展示产生的抗体片段。抗体还包括但不限于单价免疫球蛋白(例如igg)和片段，例如f(ab’)2、fab2、fab’、fab、fv、单链fv(scfv)、scfv-fc、vhh、二硫键连接的fvs(sdfv)等或其任何活性片段。
在一些实施方案中，抗体用比色探针、荧光标记、化学发光标记或放射性标记进行标记，并与包含细胞的溶液一起孵育。多种技术适于检测抗体与底物的结合(https://www.rndsystems.com/resources/protocols/detection-visualization-antibody-binding)。这些技术，包括各种荧光标记的、比色的、化学发光的或放射性标记的免疫测定，是本领域技术人员公知的。
如本发明所用，术语“结合分子”是指能够特异性结合细胞的分子，例如通过结合细胞表面上的标志物。“结合部分”包括但不限于抗体或其片段、适体(aptamers)、蛋白质支架、亲和体、小分子、肽、蛋白质、噬菌体展示scfv、mrna展示肽或mrna展示scfv等。
如本发明所用，术语“细胞”是指活生物体的最小结构和功能单位。人细胞的大小范围，例如，本发明提供的体积，为约30μm3至约4,000,000μm3。红细胞的典型细胞大小是约100μm3，巨核细胞的典型细胞大小是约30,000μm3。
如本发明所用，“细胞溶液”包括包含多个细胞的生物样品。在一些情况下，细胞溶液可任选地包括附加组分，包括但不限于缓冲液、防腐剂、稀释剂和其它分子，以有利于通过微流体装置进行处理。例如，血液样品可以含有多种红细胞和白细胞以及其它类型的细胞，例如ctc、转移性细胞和/或正常细胞。
如本发明所用，术语“腔室(chamber)”是指具有相关长度、宽度和高度的区域，例如包括支柱矩阵的矩形部件。支柱的矩阵是指一种构造，例如，网格或网格状，其中，存在多排支柱，每排具有多个支柱。因此，支柱可以被描述为多个排，每排包含多个支柱(如本发明所使用的)。或者，可以将支柱描述为多个列，每列包含多个支柱。在一些方面，每排支柱或每排支柱的至少一部分沿着具有斜率的线布置，其中，使用数学中的标准定义(例如，m＝(y2-y1)/(x2-x1)，并且其中，x、y位置是指支柱的位置)计算斜率。在这点上，相对于腔室的具有零斜率的一侧确定斜率。因此，这些支柱不是布置成平行于腔室的侧面的直线。该腔室具有一个或多个输入机构(例如，将细胞、流体、结合剂、缓冲剂等引入该腔室中)和一个或多个输出机构(例如，以便于收集浓缩的细胞，以便于收集大小分离的细胞，以连接到另一个输入机构，以连接到另一个腔室用于进一步处理等)。
如本发明所用，术语“路径(path)”或“通道(channel)”是指细胞穿过的两个相邻支柱排之间的区域(参见图2a)。当装置经配置以浓缩细胞时，细胞主要保留在特定路径中直到离开支柱矩阵为止，且通常不跨越支柱排以进入另一路径。这里，细胞通常在特定路径内流动，直到离开支柱矩阵。
当所述装置经配置以基于大小分离细胞时，所述支柱经布置以保留大于阈值的细胞且准许小于阈值的细胞穿过一排或多排支柱，借此进入两个或两个以上路径。注意，这里公开的支柱的配置不同于那些使粒子在两个或更多路径之间来回曲折(例如，路径1到路径2，路径2到路径1)的系统。本技术采用定向移动(例如，路径1到路径2，路径2到路径3)以将细胞转向腔室的一侧以用于收集。因此，尽管微流体装置可用于细胞浓缩和细胞分离，两者均使细胞侧向偏向腔室的一侧，但应理解，在细胞浓缩的情况下，细胞主要保留在单一路径中，并且在细胞分离的接触中，高于尺寸阈值的细胞主要保留在单一路径中。
如本发明所用，术语“浓度”是指溶液中组分的量的量度，例如，在特定体积的溶液中存在多少细胞、多少特定类型细胞的细胞等。
如本发明所用，术语“流速”是指单位时间内移动通过给定横截面积的流体(例如，包含细胞的溶液)的体积。
如本发明所用，术语“流体连通(influidcommunicationwith)”或“流体连接到/流体连接(fluidlycoupledto/with)”是指两个空间区域被构造成使得液体可在两个空间区域之间流动。在一些实施方案中，两个空间区域通过一个或多个阀、限流器、混合器或其他部件流体连通，所述阀、限流器、混合器或其他部件被配置用于控制包含细胞的溶液通过微流体装置的流体。应当注意，即使流体不能自由地流入与其连通的空间区域中，两个空间区域也可以流体连通。例如，即使当存在阀使得流体仅在施加压力时流入腔室时，输入机构也可以与腔室流体连通。在其它实施例中，输入机构可与流体(例如，包括细胞的溶液)可自由流入其中的腔室流体连通。
如本发明所用，术语“线性”是指直线或基本上直线。例如，对于沿直线分布的支柱，一些支柱可以稍微高于该线(例如，在约10％、5％、2％或1％的偏差内)，并且其他支柱可以稍微低于该直线(在约10％、5％、2％或1％的偏差内)。然而，作为整体，支柱基本上沿着直线分布。在其他实施例中，该列支柱可以与曲率相关联，以更有效地将细胞引导至微流体装置的一侧。
如本发明所用，术语“输入机构(inputmechanism)”是指与包括支柱矩阵的腔室流体连通的端口或其它开口。流体(例如，包含细胞的溶液)可以经由输入机构被引入微流体装置中。在一些实施方案中，注射器或泵(例如蠕动泵、真空泵、注射泵、排量泵等)可通过管道连接到输入机构，例如通过附接到微流体装置的输入机构的拧螺钉帽。可以施加压力以驱动流体流过微流体装置。在一些实施方案中，输入口可以与任选的输入腔室(没有支柱矩阵的区域)流体连通，所述输入腔室与包括支柱矩阵的腔室流体连通。
如本发明所用，术语“间距(interval)”或“间隔(spacing)”是指距离的单位。在此上下文中，间距包括固定间距(例如，相同的距离)和变化的间距(例如，变化的距离)。间距可以指连续的支柱排之间的距离(例如，垂直测量)，或相应排中连续的支柱之间的距离(例如，水平测量)。
如本发明所用，术语“微流体装置(microfluidicsdevice)”是指设计成控制小体积流体流过3d结构以进行所需操作的装置。在某些实施方案中，本发明公开的微流体装置包括用于浓缩细胞的支柱的矩阵，并且还可以进行其他操作，例如更换缓冲液和分离细胞类型。在其他实施方案中，本发明公开的微流体装置可根据尺寸或尺寸范围分选细胞。
如本发明所用，术语“输出机构(outputmechanism)”是指与包括支柱矩阵的腔室流体连通的端口或其它开口。流体(例如，包含浓缩细胞的溶液)可以经由输出机构离开微流体装置，进入贮存器中。在一些实施方案中，所述贮存器可通过管道连接至输出机构，例如，通过附接至微流体装置的输出机构的拧螺钉帽。在一些实施例中，输出端口可与任选的输出腔室(也是不具有支柱矩阵的区域)流体连通，所述输出腔室与包括支柱矩阵的腔室流体连通。
如本发明所用，术语“支柱(post)”是指在腔室内具有相关的平面内尺寸、平面外尺寸、旋转角和形状的结构。平面内尺寸可以指支柱的长度(l)和宽度(w)，而平面外尺寸可以指支柱的高度(h)。倾斜角或旋转角
图2g示出了支柱几何形状的另一个实施例。在此实施例中，所述支柱经配置以独立于大小的方式集中细胞，其中，所述支柱密集地堆积(紧密)在一起。另外，支柱之间的重叠面积已经增加(例如，通过移除支柱的尖端的一部分)，以促进细胞流动通过通道，而不是将细胞捕获在支柱之间。在此实施例中，支柱之间的距离可为约3μm，上部宽度可为约6μm，且下部宽度可为约15μm。
未活化的t细胞具有约6-8μm的直径，并且可以用这种构型浓缩。在样品内以低频率出现的癌细胞可以用这种构型与类似大小或更大的细胞，例如包括免疫细胞一起浓缩。另外，这种配置与更换缓冲液和其它处理步骤兼容，例如，如本发明所阐述的。通常，这种类型的几何构造具有增大的重叠面积、窄间隙，并且不对称。
如本发明所用，“规则间隔的间距(regularlyspacedinterval)”或“固定间距(fixedinterval)”是指具有固定距离的间距。根据本发明呈现的实施例，可沿直线以固定间隔分布支柱，例如，可沿直线或基本上直线定位支柱，例如，每5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等。
如本发明所用，术语“旋转角(rotationalangle)”是指支柱相对于其在腔室中的位置的旋转程度。在一些实施例中，支柱具有大于其宽度的长度。在该实施例中，零旋转角意味着支柱的长度与垂直于腔室的侧面的轴线对准。为了描述不同的旋转角，支柱可以顺时针或逆时针方向旋转。作为一个例子，图2a-e中的支柱以逆时针运动旋转大约35度，以达到这些图中所示的支柱的几何形状。
如本发明所用，术语“特异性结合(specificallybinds)”通常指靶实体(targetentity)(例如细胞表面上的标志物)与结合剂之间的非共价相互作用，并且通常指存在于靶实体的特定结构特征(例如抗原决定簇)与结合剂的之间的相互作用。如本领域技术人员所理解的，如果在存在其它替代相互作用的情况下发生，则认为该相互作用是特异性的。
附图说明
图1a-1b是根据本发明提供的实施方案显示用于浓缩细胞的示例性微流体腔室的图示。
图2a-2g是根据本发明提供的实施方案显示在腔室内支柱的几何形状和定位的各个方面的图示。
图3a-3b是根据本发明提供的实施方案显示用于浓缩细胞的示例性微流体腔室的图示和模拟。
图4是根据本发明提供的实施方案显示用于更换缓冲液的示例性微流体腔室的图示。
图5是根据本发明提供的实施方案显示用于将特定类型的细胞结合到结合分子并浓缩该类型的细胞的示例性微流体腔室的图示。
图6是根据本发明提供的实施方案显示具有两个单独腔室的示例性微流体装置的图示，一个腔室用于细胞浓缩，另一个腔室用于更换缓冲液。
图7是根据本发明提供的实施方案显示用于细胞浓缩、缓冲液更换和靶细胞去除的一体化模块的图示，该模块包括一个或多个本发明所述的微流体腔室。
图8a-8b是根据本发明提供的实施方案显示使用微流体腔室基于尺寸分离细胞的流程图和图示。
图9a-9b是使用本发明提供的装置和方法的示例性微流体腔室浓缩细胞的实验数据。
图10a-10d显示了包括用于更换缓冲液的微流体腔室的实验系统，其使用了本发明所提供的装置和方法。
图11a-11d显示了使用本发明提供的装置和方法激活t细胞和测定激活的t细胞的特征的方面。
图12a-12d示出了使用本发明中提供的装置和方法的微流体腔室中的各种支柱构造的示例，其中，支柱之间具有不同的间隙距离。
图13a-13f显示了使用本发明所提供的装置和方法表征活化的和非活化的t细胞的实验结果。
图14是总结使用本发明提供的装置和方法进行的各种细胞分选研究的表。
图15a-15j显示了使用本发明提供的装置和方法分选活化t细胞的实验结果。
图16a-16c显示了使用本发明提供的装置和方法，通过改变立支柱之间的距离来分选活化的t细胞的实验结果。
图17a-17f显示了使用本发明提供的装置和方法，通过改变立支柱之间的距离来细胞分选活化的t细胞的图像和直方图。
图18是总结使用本发明提供的装置和方法进行的各种抗原刺激后的细胞分选研究的表。
图19a-19f显示了使用本发明提供的装置和方法分选未刺激后的t细胞的实验结果。
图20a-20f显示使用本发明提供的装置和方法分选okt3刺激后的t细胞的实验结果。
图21a-21f显示了使用本发明提供的装置和方法分选抗原刺激后的(pp65肽池)t细胞的实验结果。
图22a-22f显示了使用本发明提供的装置和方法分选抗原刺激后的(pp65495-503)t细胞的实验结果。
图23a-23f显示了使用本发明提供的装置和方法分选抗原刺激后的(pp65肽池)t细胞的实验结果。
图24a-24f显示了使用本发明提供的装置和方法分选抗原刺激后的(pp65495-503)t细胞的实验结果。
图25显示了使用本发明提供的装置和方法用于浓缩细胞的另一种支柱的几何构造。
本发明所呈现的示例不旨在是限制性的。应当理解，在本申请中公开了这些示例的许多不同变型，并且所有这样的实施例都落入本发明所公开的实施例的范围内。
具体实施方式
提供了基于尺寸从生物样品(例如，体液)浓缩细胞或分离细胞的系统和方法。体液可以包括从患者获得的多种细胞。体液包括但不限于血液、血清、血浆、唾液、尿液、泪液、汗液、间质液、淋巴液、脑脊液、粘膜分泌物、腹膜液或其他身体分泌物或渗出物。
在一些实施方案中，体液在与微流体装置接触之前经历另外的处理。在其它实施方案中，应注意本技术可直接用于全血或稀释的全血。加工步骤还可以包括向体液中加入一种或多种另外的成分(例如，缓冲剂、生理学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂、稀释剂、乳化剂、防腐剂等)。另外，可以加入一种或多种其它成分，包括但不限于抗氧化剂、抑菌剂、缓冲剂、碳水化合物、螯合剂如edta或谷胱甘肽、阻断剂如牛血清白蛋白、着色剂、调味剂和/或芳香物质、润滑剂、ph缓冲剂、影响渗透压的盐、多肽(例如甘氨酸)、蛋白质、增溶剂、润湿剂、降低细胞粘附的物质等，其不会与细胞发生有害的反应。碳水化合物包括但不限于葡聚糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖等。可以认为，通过微器件的流体流动主要以层流的形式发生。
图1a是示例微流体装置的图示。在该实施例中，包含细胞100的溶液在输入机构110处进入腔室105。细胞被图示为圆圈。细胞通过腔室105，该腔室包括支柱115的矩阵，这里显示为沿多个具有斜率的线分布的矩形结构。当细胞在腔室中的对角取向的支柱的排之间通过时，细胞朝向输出机构122侧向偏转。图1b示出了腔室的一部分的侧视图，其中，腔室具有底板160和可选的顶板150，其可以是与支柱115相同的材料或不同的材料。显示了细胞(黑色圆圈)流过支柱的矩阵。应理解，支柱的排也可以曲线方式布置，这也将导致细胞被引导朝向腔室的一侧。
在该实施例中，示出了用于腔室的两个输出机构。通过输出机构120离开腔室的溶液消耗(depleted)了细胞，而通过输出机构122离开腔室的溶液富集了细胞。消耗(depletion)是指其中经由输出机构120离开腔室的溶液中的细胞浓度与在输入机构110处进入腔室的溶液中的细胞浓度相比已经降低50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的状态。富集(enrichment)或浓缩(concentration)是指经由输出机构122离开腔室的溶液中的细胞浓度与在输入机构110处进入腔室的溶液中的细胞浓度相比已经增加50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多的状态。为了将细胞引导至输出机构122，腔室的偏转点130应定位成使得离开的细胞被引导至输出机构122(而不是输出机构120)。通常，输出机构122被构造成具有比输出机构120更大的横截面面积。通常，输出机构将具有足够大的横截面面积，以便流体以本发明所述的流速流动，而不产生将损坏细胞或装置的高压。
在一些实施例中，输出机构120的宽度大于输出机构122的宽度。例如，输出机构120的宽度是输出机构122的宽度的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍。在其它实施例中，输出机构的横截面面积的总和可以等于或大于输入机构的横截面面积的总和。
在一些实施方案中，微流体装置被配置成允许标准泵或注射器等连接至微流体装置以使包含细胞的溶液流动通过装置。能够影响溶液通过装置的流动的参数包括腔室105的尺寸，即支柱115的平面内(inplaneofplanedimensions)和平面外(outofplanedimensions)尺寸，支柱在一排中的间距dx，支柱的旋转角
通常，细胞可以以一系列(一次一个，并且进入特定路径)或多个(流入多个路径的多个细胞)流入微流体装置。
图2a是腔室105的一部分的俯视图的图示，其中，该部分包括两排，每排七个支柱。细胞流动显示为沿着路径(p)。该图示出了支柱115在微流体装置的腔室的一部分中的定位。通常，支柱沿着具有由角度(θ)限定的斜率的线以间隔(spacing)间距(interval)(dx)对齐，该间隔间距(dx)可以是固定的或可变的，条件是该变化不导致细胞从支柱之间的路径(p)逃逸。
在一些实施方式中，腔室的宽度为1mm、2.5mm、5mm、7.5mm、10mm、12.5mm、15mm、17.5mm、20mm、30mm、40mm、50mm或更大，或者其间的任何尺寸。各个路径(p)的宽度控制流线的特性。根据腔室的宽度，可以采用任何数量的路径，例如1、2、4、8、12、16、32等，或者其间的任何范围。在其它实施方式中，流体通过所述腔室的流速可以是1ml/hr、2ml/hr、3ml/hr、4ml/hr、5ml/hr、6ml/hr、7ml/hr、8ml/hr、9ml/hr、10ml/hr、15ml/hr、20ml/hr、25ml/hr、30ml/hr、40ml/hr、50ml/hr等。腔室理想地为矩形，但也可为圆形、半圆形、v形或任何其它适当的形状。
角度(θ)是零斜率的水平轴和具有斜率的线之间的角度，支柱沿着该线分布。(在该实施例中，该角度提供了一排支柱的负斜率(tan(θ)＝δy/δx)的度量。)在该实施例中，应当理解，支柱可以具有正或负斜率，因为每排支柱都对角地布置。这里，应当理解，对角线可以包括不平行于或垂直于腔室的任何取向，例如，顺时针或逆时针，1和89度之间、91和179度之间、181和269度之间、或271和359度之间的角度。通常，在腔室中存在多排支柱，并且每排具有由角度(θ)限定的相同的斜度或基本上相同的斜度。当细胞100进入微流体装置的腔室105时，细胞以侧向(lateral)方式流经支柱115之间的多个路径(p)，流向腔室105的一侧，直到到达腔室的一侧。对于浓缩细胞，所述细胞通常不与支柱的排交叉，而是通常沿特定路径(p)行进。然后细胞通过输出机构122离开微流体腔室。在其它实施例中，支柱可以具有沿着腔室105的长度的曲线部件。
在一些实施方式中，支柱沿着具有斜率的线以间距(dx)布置，其中，该间距是规则地间隔开的或固定的。例如，可以每5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等放置一个支柱，包括在这些范围之间的任何值，这取决于要被浓缩的细胞的尺寸。
在其它实施例中，支柱沿着具有斜率的线分布，使得间距不固定，而是在任何两个连续支柱之间变化。允许任何间距(dx)，只要该间距足够小以阻止细胞逃离路径(p)。例如，对于可变间距，第一支柱可放置在特定位置处，第二支柱可放置在距第一支柱5μm处，第二支柱可放置在距第二支柱4μm处，等等。可以基于细胞的大小来选择间距。
在一些实施方案中，间距可被选择为足够大以允许特定类型的细胞的集中，同时允许较小的细胞经由输出机构120离开。例如，血液样品可以包含多种相对小尺寸的不同细胞类型，包括红细胞、嗜中性粒细胞(例如，直径12-14μm)、嗜酸性粒细胞(例如，直径12-17μm)、嗜碱性粒细胞(例如，直径14-16μm)、淋巴细胞(例如，直径10-14μm)和单核细胞(例如，直径20μm)。人体中的其它类型的细胞大得多，例如直径范围为40至100μm或更大。在这种情况下，支柱可以被间隔开以允许红细胞和白细胞通过，同时浓缩更大的细胞(例如，正常细胞、肿瘤细胞等)。基于所隔离的细胞的类型来确定支柱的配置(间距)。不同的鞘-样品流量比(sheath-to-sampleflowratios)可影响基于尺寸的分选性能。
每个支柱具有相关的长度(l)、宽度(w)和高度(h)，长度(l)、宽度(w)也被称为平面内尺寸，高度(h)也被称为平面外尺寸(也参见图2b)。在一些实施方式中，支柱的宽度可以是5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等，或其间的任何值。支柱的长度可以是5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等，或者其间的任何值。通常，支柱可以是任何形状(从自上而下的方向观察，并且相对于尺寸w和l)，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形等。
在本发明所提供的实施例中，支柱具有椭圆形或矩形形状。在一些实施例中，支柱的长度比支柱的宽度大1.1到10倍；比所述支柱的宽度大1.1至5倍；比所述支柱的宽度大2至4倍；比所述支柱的宽度大3至4倍；或者比支柱的宽度大2-3倍。在其它实施例中，矩阵中的每个支柱的长度和宽度是相同的。在其它实施例中，如果支柱是圆形的，则矩阵中的每个支柱的半径是相同的。
附加特征包括支柱的旋转角
参考图2b，每个支柱具有相关的高度(h)或平面外尺寸，使得支柱足够高以防止细胞通过向上流动的路径(例如，越过支柱顶部进入不同路径)而从路径(p)逃脱。例如，在一些实施方式中，支柱将跨越微流体腔室的高度，使得支柱与腔室的底板160和腔室的顶板150接触。在其他实施方案中，支柱的高度或超出平面的尺寸可跨越微流体装置的总高度的一部分。例如，支柱可以具有1μm、3μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等的高度，或其间的任何值。
参照图2c，每个支柱具有相关联的旋转角
如前所述，所述支柱沿着具有负斜率的线分布。通过沿着该线定向细胞，流过路径(p)的细胞被侧向地导向腔室的一侧，而细胞最初悬浮在其中的溶液能够以某种方式(例如，接近水平或水平)流动以经由输出机构120离开微流体腔室。
参考图2d，在其它实施方案中，支柱排以间距(dy)间隔排列。在一些实施例中，支柱沿着垂直线以间距(dy)排列，其中，间距规则地间隔开或固定。例如，可以每5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等放置一个支柱，包括其间的任何值，这取决于要被浓缩的细胞的尺寸。
在其它实施例中，支柱沿着垂直线分布，使得间距(dy)不固定，而是在支柱的任何两个连续排之间变化。例如，第一排支柱可放置在特定位置，第二排支柱可放置在距第一排支柱5μm处，第三排支柱可放置在距第二排支柱4μm处，等等，相对于垂直线对准。可以基于要集中的细胞的大小来选择间距(dy)。允许任何间距(dy)，条件是该间距足够宽以允许溶液流过腔室而不需要高压，高压可能损坏微流体装置。在一些实施方案中，连续的支柱排可以具有零偏移(xo)。
参考图2e，连续的支柱排可以具有相对于间距(dx)的偏移(xo)。例如，可以在特定位置(例如，使用笛卡尔坐标系x，y)建立排(r)。第(r+1)排可以向右位移一定量(xo)。第(r+2)排可以向右位移数量(2xo)。第(r+3)排可以向右位移数量(3xo)等等，直到间距(dx)。偏移可以固定方式发生，使得每个连续排在相同方向上移位固定量。或者，偏移可以以可变方式发生，使得每个连续排在相同方向上移位可变量(高达(dx)的量)。在其它实施方案中，可在交替方向上施加偏移，使得关于排(r)，第(r+1)排在一个方向上具有固定或可变偏移，且第(r+2)排在相反方向上具有固定或可变偏移(例如，一个偏移向右且下一偏移向左)。
支柱可以由任何合适的材料制成，包括聚二甲基硅氧烷(pdms)、玻璃、塑料、弹性体、硅等。pdms通常可以被制造成具有亚微米分辨率(例如，低于0.1μm特征)。在一些实施方案中，腔室105和/或支柱115可以由pdms制成。在其它实施例中，腔室可由玻璃和/或硅和/或塑料制成，且支柱可使用pdms制成(例如，腔室的底部可为玻璃或硅，且腔室的顶部可为玻璃或塑料)。本领域公知的光刻术(lithography)可以用于制造如这里所述的腔室和支柱。具有与pdms类似性质的材料也可用于构造本发明所述的微流体装置。
另外，具体实施方案可包括多个附加特征，包括阀(例如，在输入机构与腔室之间、在腔室与输出机构之间、在输出机构与另一输入机构或另一腔室之间等)、泵和混合器。在一些实施方案中，阀可以在策展(curation)期间放置到pdms中。
可以采用多种技术来制造微流体装置。微流体装置可以由以下材料中的一种或多种形成：聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚烯烃、硅氧烷(例如聚(二甲基硅氧烷)pdms)、硅、以及它们的组合。其它材料在本领域中是公知的。
使用本发明所提及的材料制造具有支柱的腔室和微流体装置的方法也是本领域已知的，并且包括但不限于压花、激光微加工、研磨、模制(例如，热塑性注射模制或压缩模制)、光刻(例如，立体光刻或x射线光刻)、硅微加工、湿法或干法化学蚀刻等。
使用光刻法，随后进行湿法(koh)或干法蚀刻(用氟或其它反应性气体的反应性离子蚀刻)的硅制造技术可用于玻璃材料。例如，玻璃母版(aglassmaster)可通过常规光刻法形成，其用作用于产生塑料或pdms基装置的模塑技术的母版模板。
微流体装置可以被制造为一层或多层，其通过例如粘合剂、夹具、加热、溶剂等结合在一起。或者，微流体装置可例如使用立体光刻或其它三维制造技术制造为单件。
在一些实施方式中，由于细胞的可变形性，与被浓缩的细胞的尺寸(例如，直径)相比，可以选择约5μm或更小的间隙距离。在其它实施例中，与被分选的细胞的尺寸(例如，直径)相比，间隙距离可以被选择为约5μm或更大。对于具有与可变形细胞相同或相似直径的刚性细胞或微球，与相同直径的可变形细胞的间隙距离相比，间隙距离可以不同(例如，对于刚性细胞更大)。
图3a-3b示出了用于细胞浓缩的示例性微流体装置的图示(图3a)和模拟(图3b)，其表示腔室150的一部分。进行模拟时(图3b)，其中，支柱间隔分开约4μm，并且支柱逆时针旋转约35度。模拟显示细胞成功地穿过路径，并且使用该设计被浓缩，因此证实该设计成功地浓缩了细胞。
在一些实施例中，可以进行附加模拟以确认用于不同细胞的其他类型的配置。
图4是另一个示例性微流体细胞浓缩器的图示。在该实施例中，包含细胞100的第一溶液在第一输入机构110处进入腔室105。细胞被图示为圆圈。细胞通过腔室105，该腔室包括支柱115的矩阵，这里显示为沿具有斜率的线分布的矩形结构。当细胞在腔室中的对角取向的支柱列之间通过时，细胞向腔室的一侧侧向偏转。与图1b类似，腔室具有底板160(未示出)和可选的顶板150，其可以是与支柱115相同的材料或不同的材料。
在该实施例中，第二输入机构112存在于该系统中。第二溶液(例如，缓冲液，其不同于通过第一输入机构110进入腔室的第一溶液)通过第二输入机构112进入腔室。在一些实施例中，第一溶液和第二溶液基本上不混合，因此，腔室155的上部区域包含第一溶液并且如果有任何第二溶液则具有少量(little)的第二溶液，而腔室165的下部区域包含第二溶液并且如果有任何第一溶液则具有少量的第一溶液。因此，当细胞侧向偏转并通过输出机构122离开腔室时，经由输出机构122离开腔室的溶液在第二溶液缓冲液中。
在一些方面，如图6所示，在级联设计中，缓冲液更换可以顺序发生。在其它方面，缓冲液更换可以并排发生。例如，流路可以被分开，使得样品流入多个腔室，其中，每个腔室包括用于缓冲液的输入机构。利用这种配置，可以向每个平行腔室提供相同的缓冲液，使得细胞被浓缩到相同的缓冲液中。或者，每个平行腔室可以提供不同的缓冲液，使得细胞被浓缩到不同的缓冲液中，例如用于不同的下游测定。
通常，输入机构可由注射泵或通过手动按压(depression)注射器来驱动。在一些方面，对于多个输入，一个或多个注射泵可以用于以自动化方式驱动每个输入。在其它方面，对于多个输入，可以使用一个或多个注射器的手动按压来手动地驱动每个输入。
图5是另一个示例性微流体细胞浓缩器的图示。在该实施例中，包含细胞100的第一溶液在第一输入机构110处进入腔室105。细胞被图示为圆圈。细胞通过腔室105，该腔室包括支柱115的矩阵，这里显示为沿具有斜率的线分布的矩形结构。当细胞在腔室中的对角取向的支柱列之间通过时，细胞侧向偏转。与图1b类似，腔室具有底板160(未示出)和可选的顶板150，其可以是与支柱115相同的材料或不同的材料。
在该实施例中，第二输入机构114存在于该系统中。第二溶液(例如，其可以与第一溶液不同或不同，并且包含能够结合第一溶液中细胞的细胞表面的分子(结合部分(bindingmoieties))，在输入机构114处进入腔室。在一些实施方案中，结合部分与细胞混合，并且结合到其细胞表面上具有合适标记的细胞。
另外，第三输入机构112存在于该系统中。第三溶液(例如，缓冲液，其可以与通过第一输入机构110进入腔室的第一溶液不同或相同，并且可以与通过第二输入机构114进入腔室的第二溶液不同或相同)通过第三输入机构112进入腔室。在一些实施方案中，第一/第二溶液和第三溶液基本上不混合，因此，腔室155的上部区域包含第一/第二溶液，并且如果有任何第三溶液，则具有少量第三溶液，而腔室165的下部区域包含第三溶液，并且如果有任何第一/第二溶液，则具有少量(little)第一/第二溶液。因此，当细胞通过输出机构122离开腔室时，经由输出机构122离开腔室的溶液包含第三缓冲液，其富含结合至结合分子(thebindingmolecule)的细胞。
通常，输入机构可由注射泵或通过手动按压注射器来驱动。在一些方面，对于多个输入，一个或多个注射泵可以用于以自动化方式驱动每个输入。在其它方面，对于多个输入，可以使用一个或多个注射器的手动按压来手动地驱动每个输入。
图6是具有多个腔室的另一个示例性微流体细胞浓缩器的图示。在该实施例中，包含细胞100的第一溶液在第一输入机构110(1)处进入第一腔室105(1)中。细胞被图示为圆圈。细胞通过腔室105(1)，其包括支柱115(1)的矩阵，在此显示为沿具有斜率的线分布的矩形结构。当细胞在腔室中的对角取向的支柱列之间通过时，细胞侧向偏转。与图1b类似，腔室具有底板(160)(未示出)和可选的顶板(150)，其可以是与支柱115相同的材料或不同的材料。(富集的)细胞通过输出122(1)离开腔室，其流入输入机构110(2)，其中，系统包括第二输入机构112。
与通过第一输入机构110(1)进入腔室的与第一溶液不同的第二溶液(例如，缓冲液)通过第二输入机构(112)进入腔室。在一些实施方案中，第一溶液和第二溶液基本上不混合，因此，腔室(155)的上部区域包含第一溶液并且如果有任何第二溶液则具有少量的第二溶液，而腔室(165)的下部区域包含第二溶液并且如果有任何第一溶液则具有很少的第一溶液。(富集的和在来自输入机构112的缓冲液中的)细胞通过输出机构122(2)离开腔室105(2)。
图7显示了另一个示例性配置，其中，系统用于缓冲液更换、细胞浓缩、激光杀死标记细胞(laserkillingoftaggedcells)和双向电泳以仅获得活细胞。在该实施例中，包含细胞100的第一溶液在第一输入机构110处进入第一腔室105(1)。细胞被图示为圆圈。一些细胞用标记物标记，例如选择性结合特定类型细胞表面的结合分子。细胞通过腔室105(1)，其包括支柱115的矩阵，在此显示为沿具有斜率的线分布的矩形结构。当细胞在腔室中对角取向的支柱的排之间通过时，细胞从第一缓冲液155侧向偏转，流入从输入机构112流出的第二缓冲液165。与图1b类似，腔室具有底板(160)(未示出)和可选的顶板(150)，其可以是与支柱115相同的材料或不同的材料。标记的细胞(现在富集的)通过输出机构122离开腔室，其流入腔室105中(2)。
一旦在第二腔室105(2)中，通过如本发明所述的支柱115的矩阵浓缩细胞。在离开腔室105(2)时，将细胞导向至与激光器200接触的区域，其中，与标记物结合的细胞在激光照射时被杀死(例如6mj，45hz，6ml/hr)。任何合适的被激光激活的标签(例如，被激活成能够杀死细胞的形式的标签，例如生热、能量耗散、裂解成毒性形式等)可以用于杀死标签所结合的细胞。在一个实施方案中，金(au)纳米棒、纳米笼或其它纳米颗粒被吸附到对溶液中的细胞类型特异性的igg抗体上。一旦细胞被激光照射，au粒子加热，并杀死金标记抗体所附着的细胞。通过利用双向电泳(参见pohlh.a.etal.,science(1966),152(3722):647)将死细胞与活细胞分离。死细胞在输出机构(126)处离开，活细胞在输出机构(128)处离开。
本发明所提供的技术可以与其它方案组合以从生物样品中分离特定细胞。例如，在一个实施方案中，获得血液样品，将其与一种或多种识别特定细胞表面标记(例如，cd2、cd14、cd19、cd45、cd61、cd66b、糖蛋白a等)的金标记抗体混合，混合物可被注入图7的系统中进行处理。例如，混合物可以经历缓冲液更换，通过第二浓缩步骤，经受激光以杀死抗体标记的(具有吸附的au纳米颗粒)细胞。可以在输出机构128处分离活细胞，其可以包括一种或多种不同类型的肿瘤细胞(例如，循环肿瘤细胞、转移性细胞等)。许多不同的配置是可能的，并且所有这样的配置落入在此公开的设备的范围内。
图8a-8b显示了根据本发明提供的实施方案，使用微流体腔室基于尺寸制备和分选细胞的流程图和图示。本发明提供的微流体装置可基于大小分离细胞，例如通过从较小细胞分离较大细胞。根据一个实施例，可根据图8a中所示的方案制备用于分离的细胞。此处，从冷冻贮存物中解冻外周血单核细胞(pbmc)。应当理解，未冷冻的血液样品也适于注入微流体装置中。cd8+t细胞可通过磁性分选获得。磁性分选的方案是本领域已知的(参见，stanciul.a.,
本发明提供的技术也可以用于由抗原刺激后的细胞。抗原包括但不限于cmvpp65、okt3等。本发明提供的技术还可以用于在刺激后，例如通过抗原、通过过表达的蛋白或其他生长/大小增强因子刺激时，大小增加不足的任何细胞类型。
图表提供了用于分离各种尺寸的细胞的间隙距离和流速的近似范围。应理解，细胞直径通常在细胞群内变化。因此，类似于下面提供的值的间隙距离也可以用于分离给定尺寸的细胞。
在另一方面，细胞分选和浓缩装置可以另外构造成在装置的底板中具有腔室，所述腔室定位在分选机构和腔室出口之间。这种配置将细胞捕获在装置的底板中。在其它实施方案中，调节流速以将细胞捕获在支柱之间的间隙中，从而允许较小细胞穿过。对于被截留细胞，可以增加流速以除去被截留细胞。
在本发明提供的技术的其他方面，腔室可以用于浓缩尿液中出现的细胞。例如，膀胱癌细胞经常脱落，因此可能存在于尿中。本发明所述的腔室可以浓缩这样的细胞。
在其它方面，本发明提供的技术可利用结合至支柱的捕获抗体来从样品中去除特定细胞(例如ctc)，或备选地，可用于去除要从加工中排除的细胞群。
应当理解，该装置可以执行本发明所述的任何功能，包括细胞浓缩、细胞分选、缓冲液更换等。
在另一个方面，所述装置可用作预处理步骤以选择用于转染的细胞，例如以提高转染产率(transfectionyields)。在该实施例中，基于较大的大小选择较大的活性细胞，例如，正在细胞分裂的细胞，并且收集到的较大细胞用于转染。
在另一个方面，该装置可用于鉴定转移性细胞。一些转移细胞变得比它们的非癌性对应物(non-cancerouscounterparts)更软，因此能够通过更小的间隙距离变形。通过调节间隙距离和流速，可以建立条件以允许转移性细胞与正常细胞分离。更坚硬的正常细胞不能通过较小的间隙距离，不被收集。
注意到其它类型的癌症，例如乳腺癌，可能导致细胞硬度或粘弹性的增加。在这种情况下，可以建立流速以允许正常细胞变形通过较小的间隙距离，而更刚性的细胞将不能通过。
在另一方面，本技术可用于收集细胞同时收获上清液。例如，在大规模蛋白质生产过程中，可以培养细胞以表达治疗性单克隆抗体或其它生物制品。本发明公开的技术提供了一种快速收集这些细胞的方法，同时收集含有表达的抗体的上清液，而无需离心或过滤步骤。
在其他方面，一个或多个微流体腔室可以被配置用于隔离具有一定范围的尺寸的细胞。例如，通过将两个腔室配置成串联取向，使得第一腔室具有8μm的截止靶(cutofftarget)，并且第二腔室具有10μm的截止靶，可以将具有在这些范围之间的尺寸的细胞作为收集的目标。
在另一方面，特定类型细胞的最佳截止尺寸可以通过产生概率截止曲线(probabilitycutoffcurve)来确定，如图17e和17f所示。可以改变间隙以找到用于各种细胞尺寸的合适截止尺寸。
另一方面，pdms或任何与pdms足够相似的材料可用于构成本发明所述的部分或全部腔室。
本发明所述的方法可以以任何顺序仅采用上述步骤中的一个或上述步骤的任何组合来浓缩和/或分离细胞。本发明所述的方法可以回收样品中至少75％、80％、90％、95％、98％或99％的期望细胞。
在另一方面，本发明所述的微流体腔室可用于分离、进行缓冲液更换和/或浓缩比样品内的其它类型的细胞大的癌细胞。在其他实施方案中，本发明所述的微流体腔室可用于在大约相同大小的非癌细胞群中浓缩癌细胞或进行癌细胞的缓冲液更换。可以在随后的(第二)分选步骤中分离癌细胞，例如使用对癌细胞特异性的染色、对癌细胞特异性的抗体等。
对于本领域技术人员来说，除了已经描述的那些之外，许多更多的修改是可能的。本发明公开的系统、方法和装置除了在所附权利要求的范围内之外不受限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应当以与上下文一致的最宽的可能方式来解释。特别地，术语“包括”和“包含”应被解释为以非排他的方式提及元件、部件或步骤，表明所提及的元件、部件或步骤可以与未明确提及的其他元件、部件或步骤一起存在、使用或组合。其中，说明书权利要求涉及选自a、b、c…的至少一种某物。以及n，文本应当被解释为仅需要来自该组的一个元素，而不是a加n，或b加n等。
实施例
实施例1.细胞分离
细胞可以从活组织检查、手术切除或从抽血获得。可以根据本领域已知的标准技术收集和储存细胞。
在一些实施方案中，使用尖锐的25号长针(例如，来自bectondickinson)进行细针抽吸。针的长度基于肿瘤在患者体内的位置来选择。针头连接到柔性塑料管，柔性塑料管连接到抽吸注射器。针的尖端被推进到肿瘤中，并且抽吸被用于收集肿瘤细胞的样本。使用成像，例如超声波检查法或任何其它合适的技术监测该过程。
将每个样品置于具有用于哺乳动物细胞的合适细胞培养基(例如5％胎牛血清(fbs)；杀真菌剂和/或杀细菌剂/抗生素)的管或烧瓶中。细胞以单层培养，例如在6孔板中，生长至汇合，例如2周或直至达到合适的细胞密度。然后收集培养的细胞，任选进行洗涤，并离心成沉淀。将细胞重悬并储存在液氮中备用。
在其它实施方案中，根据本领域已知的技术，可以从患者获得血液样品并与等渗盐水溶液混合。
实施例2.制造腔室的平版印刷
除非另外指出，否则装置是使用本领域已知的标准软光刻技术制造的。
软光刻技术可用于产生本发明所述的聚二甲基硅氧烷(pdms)结构。通常，通过光刻法制造模具(母模)，其中，模具代表微流体腔室的空的空间。在该实施例中，该母模中，流体将在其中流动的区域是实心的，并且在存在支柱的区域中是空的。例如，光刻技术可以在例如美国专利8372579中找到。
pdms是通过将含有氢化硅的组分与含有乙烯基的另一组分混合而形成的。将该混合物倒入母模中，一旦固化，在70℃下固化一小时或两小时，可将pdms结构从母模上剥离(同时保持完整)，母模可再次用于制备另外的pdms模具。
在从母模上取下pdms结构之后，以可逆或不可逆的方式将pdms结构密封到另一表面，例如玻璃、硅或pdms。在一些实施方案中，粘合性硅和/或玻璃纸胶带可与pdms结合使用，以产生适合于较低压力的可逆密封。较高的压力可能需要通过将pdms暴露于氧等离子体(oxygenplasma)而形成不可逆密封。或者，pdms可借助于极性溶剂密封，其中，极性溶剂薄膜置于pdms层之间，然后加热，蒸发溶剂并密封各层。
在其它实施方案中，更复杂的结构可以通过“夹入”或堆叠多层pdms而产生。在这样的实施方案中，利用微阶段来确保氧化之后的完美对准。这些技术是本领域已知的。
实施例3.腔室的三维印刷
或者，3d打印技术也可用于产生母模。该技术以附加方式(如cad文件所表示的)将少量材料(例如硅等)印刷为多个层，以生成三维结构。
3d打印允许快速原型制作，并且可以实现适合于一些微流体装置的分辨率。在这个实施例中，然后以与前面实施例相同的方式使用母版创建pdms腔室。
或者，cad文件可以用于直接打印腔室结构(而不是相反的结构)。然后可以用pdms涂布该结构以具有所需的表面性质。(waheed,etal.,labchip(2016)16:1993-2013.)
这些实施例纯粹旨在是示例性的，而不旨在是限制性的，因为多个不同的实施例被理解为落入本发明所公开的系统、方法和设备的范围内。
实施例4.细胞浓缩
在一个实施方案中，获得包含细胞的生物样品。将样品装入注射器，该注射器通过管道与微流体装置的输入机构110连接(参见例如图3，9a-9b)。一旦手动按压注射器的柱塞，流体就通过管道流入输入机构，并通过包括支柱矩阵的腔室。细胞朝向微流体腔室的一侧侧向偏转，并经由输出机构122离开腔室。在离开时收集现在浓缩的细胞。
图9a示出了用于细胞浓缩的示例微流体装置的实验结果。拍摄了腔室115的不同部分的图像，其中，sec1示出了最靠近输入机构的腔室的一部分，sec5示出了最靠近输出机构的腔室的一部分。实线箭头示出了流过腔室的细胞100的位置。当细胞通过小腔室时，细胞被侧向引导，并从支柱矩阵(sec5)中出来。
图9b示出了用于细胞浓缩的示例微流体装置的实验结果，其中，流速为20ml/hr并且所实现的细胞浓度为105ml/ml，相对于输入浓度提高了10-11倍。细胞通过输出机构122离开该腔室。
实施例5.缓冲液更换
在另一个实施方案中，获得生物样品。将样品装入注射器，该注射器通过管道与微流体装置的输入机构(例如与腔室流体连通的输入口)连接(参见例如图6，10a-10d)。将含有缓冲液(不同于含有生物样品的溶液)的第二溶液与第二输入机构连接，并且手动注射器提供适量的压力以使第二溶液以恒定速率流过腔室。使用者手动按压注射器，流体从注射器流入包括支柱矩阵的腔室。细胞朝向微流体腔室的一侧偏转，并经由输出机构122离开。现在浓缩的和在新的缓冲液(第二溶液)中的细胞，在离开时被收集。
图10a-10d示出了用于细胞浓缩的示例性微流体装置的实验结果，包括缓冲液更换。图10a显示了两个输入机构(在这种情况下，与管道连接)进入具有两个输出机构(也与管道连接)的腔室的微流体装置。图10b示出了阿罗拉红ac食用染料(alluraredacfooddye)进入腔室，其中，腔室155的部分保留来自输入机构110的溶液，腔室165的部分保留来自输入机构112的溶液。图10c示出了输出机构122。图10d示出了用于细胞浓缩的示例性微流体装置的实验结果，其中，流速为20ml/hr，所达到的浓度为105ml/ml，比输入浓度提高了5-6倍。在该实施例中，完全的缓冲液(培养基)更换迅速发生，并且没有利用耗时的过程，例如离子扩散。在本实施例中，q鞘为0.01ml/hr～100ml/hr，q样品为0.01ml/hr～100ml/hr。
通常，输入机构可由注射泵或通过手动按压注射器来驱动。在一些方面，对于多个输入，一个或多个注射泵可以用于驱动每个输入。在其它方面，对于多个输入，可以使用一个或多个针筒的手动按压来驱动每个输入。
实施例6.结合分子
在另一个实施方案中，从患者处获得生物样品(例如血液样品)。用氯化钠等渗盐水稀释样品，并将其装载到注射器中，该注射器通过管道连接到微流体装置的输入机构(例如，与腔室流体连通的输入口)(参见图5)。使用者手动按压注射器，流体从注射器流入包括支柱矩阵的腔室。含有结合分子(结合到细胞上特定类型标记物的分子)的第二溶液连接到第二输入机构，并且另一注射器提供适量的压力以使包含结合分子的溶液以恒定速率流过腔室。细胞与结合分子在腔室中混合，并且标记的细胞朝向微流体腔室的一侧偏转。第三溶液包含与包含细胞的溶液不同的缓冲液(165)，并且包含结合分子的溶液与第三输入机构连接。细胞(标记的和未标记的)朝向流体腔室的一侧偏转并且经由输出机构(122)离开。在离开时收集现在浓缩和标记的(和在第三溶液中的)细胞。在其它实施方案中，第三输入机构是任选的，并且该方法可限于标记和浓缩细胞。
通常，输入机构可由注射泵或通过手动按压注射器来驱动。在一些方面，对于多个输入，一个或多个注射泵可以用于驱动每个输入。在其它方面，对于多个输入，可以使用一个或多个针筒的手动按压来驱动每个输入。
实施例7.浓缩器和缓冲液更换
在另一个实施方案中，从患者处获得生物样品(例如，血液样品)。用氯化钠等渗盐水稀释样品并装入注射器，该注射器通过管道连接到微流体装置的输入机构(例如，与腔室流体连通的输入口)(图6)。一旦手动按压注射器，流体从注射器通过输入口流动，然后流入包含支柱矩阵的腔室105(1)中。细胞向微流体腔室的一侧偏转，并通过输出机构(122(1))离开。现在浓缩的细胞流入第二腔室，其中，第二腔室也具有输入口，含有缓冲液的第二溶液(不同于含有血液样品的第一溶液)通过第二输入机构110(2)流入第二腔室105(2)。泵提供适量的压力以使第二溶液以恒定的速率流过腔室。使用者手动按压注射器，流体从注射器通过第一腔室流入包括支柱矩阵的第二腔室。细胞向微流体腔室的一侧偏转，并通过输出机构(122(2))离开。现在浓缩的和在新的缓冲液(第二溶液)中的细胞，在离开时被收集。
实施例8.一体化
在另一个实施方案中，从患者处获得生物样品(例如，血液样品)。用氯化钠等渗盐水稀释样品并装入注射器，该注射器通过管道连接到微流体装置的输入机构(例如，与腔室流体连通的输入口)(图7)。该实施例显示了另一个实施例配置，其中，系统进行缓冲液更换、细胞浓缩、标记细胞的激光杀死和双向电泳以仅获得活细胞。在该实施例中，包含细胞100的第一溶液在第一输入机构110处进入第一腔室105(1)。细胞被图示为圆圈。一些细胞用标记物标记，例如选择性结合特定类型细胞表面的结合分子。细胞通过腔室105(1)，其包括支柱115的矩阵，在此显示为沿具有斜率的线分布的矩形结构。当细胞在腔室中对角取向的支柱的排之间通过时，细胞从第一缓冲液155侧向偏转，流入从输入机构112流出的第二缓冲液165。与图1b类似，腔室具有底板(160)(未示出)和可选的顶板(150)，其可以是与支柱115相同的材料或不同的材料。标记的细胞(现在富集的)通过输出机构122离开腔室，其流入腔室105中(2)。
一旦在第二腔室105中(2)，通过如本发明所述的支柱115的矩阵浓缩细胞。在离开腔室105时(2)，将细胞导向至与激光器200接触的区域，其中，与标记物结合的细胞在激光照射时被杀死(例如6mj，45hz，6ml/hr)。任何合适的被激光激活的标签(例如，被激活成能够杀死细胞的形式的标签，例如生热、能量耗散、裂解成毒性形式等)可以用于杀死标签所结合的细胞。在一个实施方案中，金(au)纳米棒、纳米笼或其它纳米颗粒被吸附到对溶液中的细胞类型特异性的igg抗体上。一旦细胞被激光照射，au粒子加热，并杀死金标记抗体所附着的细胞。通过利用双向电泳(参见pohlh.a.etal.,science(1966),152(3722):647)将死细胞与活细胞分离。死细胞在输出机构(126)处离开，并且活细胞在输出机构(128)处离开。
实施例9.根据大小分选细胞
对于以下涉及通过facs进行细胞分选的实施例和附图，可以根据经验确定边界框(例如，黑色多边形)。
图11a-11d显示了根据本发明提供的实施方案的基于尺寸的细胞分选和分离的图像和实验结果。
根据本发明提供的方面，微流体装置也可用于细胞分选，例如富集已通过与特定抗原结合或通过添加引起t细胞活化的物质而活化的t细胞。图11a和11b显示了活化时t细胞大小增加，并且在活化后约24小时发生大小增加(参见guoetal.,naturecommunication(2016)7:10307)。
在本研究中，如图11c和11d所示，基于细胞大小定量细胞活化，如通过前面的分选(fsc)测量和作为cd25表达的函数。未刺激的细胞位于左下象限，具有较小的尺寸，cd25表达降低。在该研究中，显示早在刺激后两天，并持续刺激后三天，就观察到具有较大尺寸和增加的活化标记cd25表达的细胞群。
图12a-12d显示了细胞分选装置的各种配置。参照图12a，每个支柱具有相关联的倾斜角或旋转(也参见图2c)和形状。为了确定间隙距离，可以在第一支柱的下部和相邻支柱的上部中绘制圆，并且可以在两个相邻支柱之间形成连接每个圆的中心的线。如图12a所示，间隙距离是沿着该线的两个相邻支柱之间的最小距离，在这种情况下，其大约为4μm。图12b和12c显示了6μm和9μm的间隙距离，图12d显示了hl-60细胞的实验图像，所述细胞在本发明所述的微流体腔室中进行了尺寸分离。hl-60细胞，一种癌细胞系，大小范围为约10至15μm，使用9μm间隙距离进行细胞分离。在这种情况下，收集直径约11μm的细胞，同时较小的细胞流过腔室进入废弃物容器。因此，多种因素影响细胞分离，包括微流体装置的支柱的间隙距离和倾斜/旋转角。
在一些方面，间隙距离可以基于细胞的尺寸和粘弹性(viscoelasticnature)来选择。通常，细胞是可变形的，并且在每个侧面上可以变形约2-3μm。因此，为了选择在每侧上变形大约2μm的8μm细胞，可以使用4μm的间隙距离。对于较大尺寸的细胞，此相同趋势可成立，例如，对于10μm细胞，截止尺寸(cutoff)为6μm，且对于13μm细胞，截止尺寸为9μm。在一些情况下，较大的细胞可变形通过较小的间隙，并且在这种情况下，可向上调节流速以减少这种情况的发生。
在一些方面，支柱可以包覆有引起细胞与支柱结合的试剂，例如抗体、抗原等。在该实施例中，抗原或抗体抑制细胞移动通过腔室，并且可以基于尺寸和通过腔室的迁移速度分离细胞。
实施例10.用cd3和cd28mab刺激和分选t细胞
对于涉及通过facs的细胞分选的以下实施例和附图，可以根据经验确定边界框(例如，图13a中所示的黑色多边形等)。
参考图13a-13f，使用cd3抗体和cd28抗体组合刺激来自pbmc混合物的细胞。这种技术可用于广泛刺激t细胞，并且不是抗原特异性的。图13a和13d显示了未刺激和刺激后细胞的侧向散射(ssc-a)对前向散射(fsc-a)。刺激后的细胞显示尺寸增加。图13b-13f显示了对于相当高纯度的细胞(90％cd8t细胞和95％cd3t细胞)，用cd3抗体和cd28抗体进行刺激，成功刺激了大量细胞，其出现在左上象限，反映大小增加和活化标记物的表达。
图14显示了基于变化的间隙宽度(4μm、9μm和6μm)、细胞类型(cd4和cd8)、刺激时间和一或两轮分选的细胞分选结果的表。对于两轮分选，将第一轮的输出物返回到细胞腔室中以进行第二轮分选。
在该实施例中，在将1-10％cd25+活化的t细胞掺入后，将包含cd25+细胞(活化的t细胞)的溶液供入腔室。最大的间隙，9μm间隙，在分选后提供最高的富集百分比。对于9μm间隙，结果显示在1轮分选后约90％，在2轮分选后94％。通过定量表达活化标记物cd25+的细胞除以初始cd25+混合物的百分比确定富集因子。
参考图15a-15j，显示了使用9μm间隙的细胞富集结果。对于第一轮富集期间的1.1％掺入(spike)(图15d)，62.5％的细胞表达活化标记cd25(图15e)，而仅0.2％的废弃细胞(wastecells)表达cd25(图15f)。在第二轮富集期间，71.8％的细胞表达活化标记物cd25(图15i)，而仅0.3％的废弃细胞表达cd25(图15j)。
图16a-16c示出了穿过不同间隙的支柱(也称为台柱(pillars))的细胞的散点图。用4μm间隙分选，产生的细胞群大部分在左下象限，表明尺寸较小。用9μm间隙分选产生了在多个象限中更分散的细胞群体。
参照图17a-f，分选后拍摄细胞的照片，并测量细胞的直径。图17a和17b示出了在4μm间隙下进行分选时的收集细胞和废弃细胞的图像。图17e中显示了相应的直方图，显示了收集细胞(collectioncells)和废弃细胞的细胞尺寸分布。图17c和17d示出了在9μm间隙下进行分选时的收集细胞和废弃细胞的图像。图17f显示了相应的柱状图，显示了收集细胞和废弃细胞的细胞尺寸分布。
实施例11.用抗原刺激和分选t细胞
在这一系列实施例中，在细胞分选之前以抗原特异性方式刺激t细胞。将广泛用于刺激t细胞的okt3用作阳性对照。使用pp65进行抗原特异性刺激。在一些实施方案中，使用pp65肽池(pp65peptidepool)来刺激t细胞，所述肽池例如包含跨越全长pp65蛋白序列的多个重叠肽。在其它实施方案中，使用对应于pp65蛋白的残基495-503的pp65495-503的特异性抗原刺激t细胞。
一般而言，与pp65495-503抗原相比，pp65肽池产生更高频率的被刺激t细胞，因为pp65肽池包含多种不同类型的抗原，能够刺激一系列t细胞。相比之下，单一抗原pp65495-503刺激对该抗原特异的t细胞，导致模拟t细胞的频率较低。
pbmc细胞以及t细胞、b细胞和单核细胞的混合物，从对pp65抗原具有反应性的供体处获得。特别地，将pbmc细胞，例如来自hla-a2、cmv血清阳性供体lp381(正常应答)的pbmc细胞解冻。将细胞分成含有约8×106个细胞的等分试样。在各种条件下培养等分试样，包括：(1)仅在培养基存在下(未刺激)；(2)在okt3存在下(刺激后)；(3)在pp65肽池存在下(刺激后)；和(4)在pp65495-503存在下(刺激后)。在刺激后的第三天，将每组的细胞基于尺寸进行分选，间隙距离为9μm，q总＝10ml/hr，样品：鞘比约为1:1。在刺激后的第四天，基于尺寸对第三和第四组进行分选，间隙距离为9μm，q总＝10ml/hr以及样品：鞘为1:1，或者q总＝20ml/hr以及样品：鞘比为4:1。分选后，通过流式细胞术(facs)分析样品以记录下列三个时间点的细胞计数，包括fsc、ssc、cd3、cd25和cmv右旋糖酐聚合物(dextramer)(pp65495-503)：在分选之前、分选之后(收集物)和分选之后(废弃物)。
图18是总结在上述条件下cd25+t细胞收集物的表。
单核细胞和活化的t细胞(cd3+cd25+细胞)经常一起分离，因为单核细胞通常比淋巴细胞(b细胞和t细胞)大。当活化的t细胞(基于cd25+)对所有活细胞门控(gated)(分选)时，收集的活化t细胞的百分比(纯度)由于单核细胞的存在而较低。当活化的t细胞对cd3+细胞门控时，收集的活化t细胞的百分比(纯度)更高，在一些情况下肽池刺激时达到大于90％。
计算活细胞(由所有活pbmc细胞组成，包括t细胞(大部分)、b细胞、单核细胞、cd3-淋巴细胞等)中cd25+活化t细胞的百分比。还计算了cd25+细胞在由cd3+细胞组成的t细胞(例如，cd3+cd25-和cd3+cd25+细胞)中的百分比。与在活细胞上设门相比，当仅在cd3+t细胞上设门时，cd25+细胞的百分比更高(因为排除了其他细胞类型)。
富集因子是分选后cd25+百分比(％)的倍数增加，并用收集到的的cd25+细胞的百分比除以未分选的细胞来计算。例如，参考图24d，分选之前的cd25+百分比为0.055/(0.055+47.4)＝0.1％。分选后，cd25+百分比为0.16/(0.16+0.65)＝19.7％。
图19a-24f显示了各种细胞分选测定以及对照的结果。在一些方面，在facs分选之前，可以对细胞进行染色以检测cd25+和cd3+。在一些实施方案中，活化的t细胞(cd3+cd25+)可以占进行分选的总pmbc细胞群的约1％(或更少)。
本发明提供的细胞分选测定可与一种或多种其它测定组合以分离目的细胞，例如使用染色、抗体等。分选后，与未分选的对应物相比，抗原刺激后的t细胞(cd25+cd3+)显示为已富集的。
与活化的t细胞大小大致相同的单核细胞也可能出现在收集的部分中，而较小的细胞，例如cd3+cd25-细胞和cd3-淋巴细胞通常被排除在外。
图19a-19c显示了未刺激细胞在分选前和刺激后三天分选(收集物和废弃物)后的fsc-a和ssc-a的比较。活细胞被封闭在黑色多边形内。图19d-19f显示了分选前后(收集物和废弃物)的各种细胞群(cd3+cd25-细胞、单核细胞、cd3-淋巴细胞和cd3+cd25+细胞)。
图20a-20c显示刺激后细胞(用okt3)分选前和刺激后三天分选(收集物和废弃物)后的fsc-a和ssc-a的比较。活细胞被封闭在黑色多边形内。图20d-20f显示了分选前后(收集物和废弃物)的各种细胞群(cd3+cd25-细胞、单核细胞、cd3-淋巴细胞和cd3+cd25+细胞)。在okt3刺激后的条件下，当门控cd25+活细胞时观察到约1倍富集因子，并且当门控cd25+cd3+细胞时观察到约1倍富集因子。
图21a-21c显示了刺激后细胞(用pp65肽池)分选前和刺激后三天分选(收集物和废弃物)后的fsc-a和ssc-a的比较。活细胞被封闭在黑色多边形内。图21d-21f显示了分选前后(收集物和废弃物)的各种细胞群(cd3+cd25-细胞、单核细胞、cd3-淋巴细胞和cd3+cd25+细胞)。在pp65肽池刺激后的条件下，当门控cd25+活细胞时观察到约11倍富集因子，并且当门控cd25+cd3+细胞时观察到约40倍富集因子。
图22a-22c显示了刺激后细胞(用pp65495-503)分选前和刺激后三天分选(收集物和废弃物)后的fsc-a和ssc-a的比较。活细胞被封闭在黑色多边形内。图22d-22f显示了分选前后(收集物和废弃物)的各种细胞群(cd3+cd25-细胞、单核细胞、cd3-淋巴细胞和cd3+cd25+细胞)。在pp65495-503刺激后的条件下，当门控cd25+活细胞时观察到约5倍富集因子，并且当门控cd25+cd3+细胞时观察到约150倍富集因子。
图23a-23f显示刺激后四天在不同流动条件下使用65pp肽池的抗原特异性刺激。在一些实施方案中，与以较低流速(例如，q＝10ml/hr，1:1)分选的细胞相比，以恒定间隙距离(例如，9μm)以较高流速(例如，q＝20ml/hr，4:1)分选的细胞纯度相同或略有提高。
参见图24a-24f，在刺激后四天在不同的流动条件下使用pp65495-503进行抗原特异性刺激。在快速流动条件(20ml/hr，4:1)下活化的t细胞(cd3+cd25+)的回收率与慢速流动条件(10ml/hr，1:1)相比大致相同或更好。
图25显示了微流体腔室的另一个实施方式，其被配置成以尺寸独立的方式浓缩细胞(也参见图2g)。在该实施例中，支柱被密集地封装在一起。另外，增加了支柱之间的重叠面积(例如，通过移除支柱的尖端的一部分)以促进细胞通过通道流动，而不是将细胞捕获在支柱之间。
实施例12.微流体通道的启动
通常，任何合适的材料可用于在微通道内形成支柱。优选地，该材料是气体可渗透的，例如pdms，以允许截留的气体从微流体通道逸出，并防止截留的气泡影响微流体通道内的流体动力学。微流体通道和相关的管道可以用合适的缓冲液填充并用过量的缓冲液冲洗，以允许截留的气泡被去除并通过pdms扩散到微流体通道外或通过连接到微流体通道的管道离开。在一些实施方案中，可以将表面活性剂加入到缓冲液中以减少气泡的发生。
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