一种可重复使用的固定金属离子亲和色谱吸附剂及其制备和应用的制作方法

1.本发明涉及一种可重复使用的固定金属离子亲和色谱吸附剂的制备及其在富集磷酸肽方面的应用。具体是以带有环氧基团的聚合物微球为基质，分别用3,4,5-三羟基苯甲醛和ti
4+
进行修饰，制备一种可用于磷酸肽富集的固定化金属离子亲和色谱功能材料，由于富集-洗脱磷酸肽过程的可逆性，该材料用作吸附剂可被重复使用。


背景技术：

2.在人体生命中，蛋白质的磷酸化修饰是一种非常复杂的蛋白质翻译后修饰，其参与了几乎所有的生命活动过程，包括细胞的繁殖、发育、分化和凋亡等。磷酸化的异常通常都与疾病相关，如白血病，老年痴呆，癌症等，因此研究蛋白质的磷酸化过程和机理具有重要的理论和现实意义(文献1，ubersax j.a.,et.al"mechanism of specificity in protein phosphorylation"nat.mol.cell.2007,8,530-541；文献2，huttlin e.l.,et al."architecture of the human interactome defines protein communities and disease networks"nature 2017,545,505-509)。基于质谱分析的蛋白质组学研究方法是目前研究磷酸化肽使用最广泛的工具之一。但是由于蛋白酶解产物中磷酸化肽段的丰度低，非磷酸化肽干扰严重，因此样品在进入质谱之前必须进行分离富集。
3.目前已经发展出了多种用于富集磷酸肽的方法，如固定金属离子亲和色谱，金属氧化物亲和色谱，硼亲和色谱，离子交换色谱等。其中，固定化金属离子亲和色谱(imac)是一种富集效率很高的富集策略，它的富集原理是利用螯合在基质上的带正点的金属离子(如ti
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、ge
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、fe
3+
、zr
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)与带负电的磷酸基团发生的螯合作用，从样品溶液中特异性地吸附磷酸肽(文献3，li x.,et al."recent advances in phosphopeptide enrichment:strategies and techniques".trac-trend anal.chem.2016,78,70
–
83；文献4，相小超等."功能材料在蛋白质组研究中的应用进展"2019,37,1135-1141)。以磷酸基团为配体制备的imac吸附剂已被证明可以有效地富集磷酸肽，但是这些材料的使用大多是一次性的，不可重复使用(zhang h.et.al."one-step preparation of phosphate-rich carbonaceous spheres via a hydrothermal approach for phosphopeptide analysis"green.chem.2019,21,2052-2060)。


技术实现要素：

4.本发明涉及一种可重复使用的磷酸肽富集材料。具体是先以二缩三丙二醇二丙烯酸酯(tpgda)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)为单体，采用悬浮聚合法制备带有环氧官能团的聚合物微球，接着采用乙二胺对微球表面进行氨基化处理，然后以3,4,5-三羟基苯甲醛为修饰剂，在微球表面引入邻苯三酚基团，最后将其与ti
4+
离子进行螯合，制备可用于磷酸肽富集的ti
4+-imac吸附剂(图1a)。由于富集-洗脱磷酸肽过程的可逆性，用碱性洗脱液可将磷酸肽从吸附材料上解离下来，用酸性上样溶液平衡后可开始下一轮富集过程。由于吸附
材料基质是有机聚合物微球以及表面邻苯三酚基团与ti
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之间的较强螯合作用力，碱性洗脱溶液不会将材料腐蚀，也不会使固定在材料表面的ti
4+
解离，因此该材料作为imac吸附剂可被重复使用(图1b)。
5.其结构示意式如下所示：
[0006][0007]
ti
4+-imac功能材料的具体制备过程包括如下步骤：
[0008]
(1)带有环氧官能团的聚合物微球的制备：先将0.2～0.6g的聚乙烯醇加入到20～60ml水-甲苯的混合溶剂中(水/甲苯＝5/1～5/3，体积比)，在50～150rpm的机械搅拌下，升温到70～85℃使其完全溶解后再冷却至室温；然后逐滴加入2.0～4.0ml甲基丙烯酸缩水甘油酯和3.0～6.0ml二缩三丙二醇二丙烯酸酯，接着加入50～100mg的过氧化苯甲酰，继续以50～150rpm的搅拌速率进行机械搅拌，2～3h后升温至85～95℃，继续反应2～4h后停止加热；产物依次用甲醇和水为洗涤剂进行洗涤，50～70℃真空干燥6～12h，得到带有环氧官能团的聚合物微球；
[0009]
(2)邻苯三酚功能化的聚合物微球的制备：在容器中将1.0～3.0g步骤(1)中得到的带有环氧官能团的聚合物微球分散在20～50ml无水乙二胺中，在60～80℃条件下，以50～150rpm的搅拌速度加热回流4～8h；反应结束后，用乙醇将材料洗至中性，得到氨基功能化的聚合物微球；接着将该微球分散到50～200ml浓度为0.02～0.05g/ml的3,4,5-三羟基苯甲醛的乙醇溶液中，在60～80℃条件下，以50～150rpm的速率搅拌，加热回流4～12h，产物用乙醇洗涤；然后再将得到的产物分散在50～200ml浓度为0.005～0.02g/ml的硼氢化钠水溶液中，室温下以50～150rpm的速率搅拌2～10h；反应结束后，所得材料用水洗至中性，得到邻苯三酚基团功能化的聚合物微球；
[0010]
(3)ti
4+-imac功能材料的制备：将步骤(2)中得到的邻苯三酚基团功能化的聚合物微球材料重新分散在10～20ml浓度为0.5～1.0g/ml的硫酸钛(ti(so4)2)溶液中，室温下以50～150rpm的频率，孵育振荡反应4～16h，反应结束后用去离子水洗涤至中性，50～80℃真空干燥5～12h，得到ti
4+-imac功能材料。
[0011]
本发明的特征在于：
[0012]
(1)以二缩三丙二醇二丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯为功能单体，采用悬浮聚合法制备带有环氧官能团的聚合物微球；依次用乙二胺、3,4,5-三羟基苯甲醛、硼氢化钠、ti
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进行修饰，制备ti
4+-imac功能材料；
[0013]
(2)该材料可用作固定化金属离子亲和色谱的吸附材料，对生物样品中的磷酸肽具有很高的富集效率和选择性；
[0014]
(3)该材料作为磷酸肽富集材料可以被重复使用。
[0015]
由于ti
4+
离子与邻苯三酚基团之间的螯合作用力比其与磷酸根之间的作用力强，所以在磷酸肽吸附完成后，采用适当的碱性洗脱剂可以破坏ti
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离子与磷酸肽之间的作用力(使富集到的磷酸肽从吸附剂上解离进入洗脱液)，而不影响ti
4+
离子与邻苯三酚基团之
间的螯合作用(ti
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不从吸附剂上解离)，同时聚合物基质也不会被腐蚀，用酸性上样溶液平衡后即可进行下一轮富集流程。因此，该吸附剂可以被重复使用。而传统的以磷酸根基团为配体的imac吸附剂，金属离子在碱性洗脱液中会随着磷酸肽从吸附剂上一同脱落，因而只能一次性使用。
[0016]
本发明所采用的制备方法，操作简单，原料易得，成本低廉，反应条件温和，适用于大规模制备。所得ti
4+-imac功能材料对磷酸肽富集效果好，特异性强，而且可以重复使用，极大地降低了富集实验的成本，符合国家倡导的“绿色环保”理念。
附图说明
[0017]
图1.ti
4+-imac功能材料的(a)制备与(b)使用示意图。
[0018]
图2.实施例1中，ti
4+-imac-1功能材料扫描电镜图。
[0019]
图3.实施例1中，ti
4+-imac-1功能材料的(a)氮气吸附脱附等温线图，(b)孔径分布图。
[0020]
图4.实施例1中，ti
4+-imac-1功能材料的x-衍射光电子能谱图。(a)全谱图，(b)ti 2p高分辨能谱图。
[0021]
图5.实施例1中，ti
4+-imac-1功能材料对β-酪蛋白酶解液(a)富集前，(b)第一次富集后的maldi-tof-ms图以及(c)重复使用10次从β-酪蛋白酶解液中富集到的三条特征肽段的信号强度变化曲线图。(*)代表磷酸肽，(
·
)代表去磷酸碎片。
[0022]
图6.实施例1中，ti
4+-imac-1功能材料对β-酪蛋白和牛血清白蛋白混合酶解液富集前后的maldi-tof-ms对比图。(a)富集前，(b)富集后。(*)代表磷酸肽，(
·
)代表去磷酸碎片，β-酪蛋白与牛血清白蛋白的质量比为1/100。
[0023]
图7.实施例2中，ti
4+-imac-2功能材料扫描电镜图。
[0024]
图8.实施例2中，ti
4+-imac-2功能材料对β-酪蛋白酶解液(a)第一次富集后的maldi-tof-ms图以及(b)重复使用10次从β-酪蛋白酶解液中富集到的三条特征肽段的信号强度变化曲线图。(*)代表磷酸肽，(
·
)代表去磷酸碎片。
[0025]
图9.对比案例中，商品化的imac微球对β-酪蛋白酶解液富集后的maldi-tof-ms图。(a)第一次富集，(b)重复使用第二次富集。(*)代表磷酸肽，(
·
)代表去磷酸碎片
具体实施方式
[0026]
实施例1基于邻苯三酚配体的可重复使用的ti
4+-imac-1功能材料用于磷酸肽的分离富集
[0027]
可重复使用的ti
4+-imac-1功能材料的制备
[0028]
(1)带有环氧官能团的聚合物微球的制备：先将0.4g的聚乙烯醇加入到40ml水-甲苯的混合溶剂中(水/甲苯＝5/2，体积比)，在100rpm的机械搅拌下，升温到80℃使其完全溶解后再冷却至室温；然后逐滴加入2.0ml甲基丙烯酸缩水甘油酯和4.0ml二缩三丙二醇二丙烯酸酯，接着加入60mg的过氧化苯甲酰，继续以100rpm的搅拌速率进行机械搅拌，2h后升温至80℃，继续反应2h后停止加热；产物依次用乙醇和水为洗涤剂进行洗涤，60℃真空干燥6小时，得到带有环氧官能团的聚合物微球；
[0029]
(2)邻苯三酚功能化的聚合物微球的制备：在圆底烧瓶中将2.0g步骤(1)中得到的
带有环氧官能团的聚合物微球分散在30ml无水乙二胺中，在60℃的油浴中，以100rpm的搅拌速度加热回流6h；反应结束后，用乙醇将材料洗至中性，得到氨基功能化的聚合物微球；接着将该微球分散到50ml浓度为0.02g/ml的3,4,5-三羟基苯甲醛的乙醇溶液中，在70℃的油浴中，继续以100rpm的速率搅拌，加热回流6h，产物用乙醇洗涤3次；然后再将得到的产物分散在100ml浓度为0.01g/ml的硼氢化钠水溶液中，室温下以100rpm的速率搅拌4h；反应结束后材料用水洗至中性，得到邻苯三酚功能化的聚合物微球；
[0030]
(3)ti
4+-imac-1功能材料的制备：将步骤(2)中得到的材料(邻苯三酚功能化的聚合物微球)分散在20ml浓度为0.5g/ml的硫酸钛(ti(so4)2)溶液中，室温下以120rpm的频率，孵育振荡反应8h，反应结束后用水洗涤至中性，60℃真空干燥12h，得到ti
4+-imac-1功能材料。
[0031]
酶解样品的制备：先将1mgβ-酪蛋白/牛血清白蛋白溶解在含有8m尿素的100mm的碳酸氢铵溶液中，调节溶液ph为8.2。加入80μmol二硫苏糖醇，在60℃水浴下反应1h，再加入40μmol碘代乙酰胺，室温下避光40min。接着用100mm的碳酸氢铵溶液将尿素浓度稀释到1m，按照蛋白与胰蛋白酶的质量比为25:1的比例加入胰蛋白酶，在37℃的水浴中反应16h，将得到的酶解液用c18 spe小柱除盐，冻干后保存在-20℃的冰箱中备用。
[0032]
磷酸化肽的富集：称取5mg ti
4+-imac-1微球材料于离心管中，用上样溶液(80％acn，6％tfa，v/％)平衡材料3次。将10μg冻干后的蛋白质酶解液用200μl上样溶液复溶，并转移至离心管中，在室温下振荡30min。以14,000rpm的转速离心，除去上清溶液。用洗涤溶液a(200mm nacl，50％acn，6％tfa，v/％)洗涤三次以除去材料上吸附的非特异性肽段，再用洗涤溶液b(30％acn，0.1％tfa，v/％)洗涤三次除去材料中的盐，每次各振荡30min。最后用100μl洗脱液(质量百分比为10％的氨水)将材料上吸附的磷酸肽洗脱下来。洗脱液用maldi-tof ms分析。
[0033]
maldi-tof ms分析过程：
[0034]
先将0.5μl洗脱液滴加在madli靶上，自然晾干。再将0.5μl浓度为25mg/ml的2,5-二羟基苯甲酸溶液覆盖到样品点上，待完全晾干后，送入质谱仪进行分析。
[0035]
材料表征
[0036]
图2为实施例1所制备的ti
4+-imac-1功能材料的扫描电镜图。从图中可以看出，该材料外观为球形，粒径范围100～150μm，表面粗糙含有大量的孔道结构。氮气吸附脱附实验结果(图3)显示，该材料的孔径分布较宽，介孔主要分布在32nm附近，比表面积为65.8mg2/cm。x-衍射光电子能谱图可以用来表征材料中的元素，如图4所示，ti
4+-imac材料的谱图中出现了n元素和ti元素。其中n元素来源于氨化修饰，ti元素来源于配体与钛离子的螯合作用，这一结果表明钛离子成功被固定到了聚合物微球的表面。
[0037]
材料应用
[0038]
将ti
4+-imac-1功能材料作为imac吸附剂，对β-酪蛋白酶解液中的磷酸肽进行了富集。图5a为富集前的maldi-tof图，由于非磷酸肽的干扰，图中没有一条明显的磷酸肽信号可被观察到，而用ti
4+-imac-1功能材料富集后(图5b)，非磷酸肽几乎没有干扰，质谱图中仅出现了三条特征磷酸肽(2061，2555，3122，m/z)以及它们的去磷酸碎片离子峰(1963、2458、3024、2926，m/z)的信号，这表明ti
4+-imac-1对磷酸肽具有很高的富集性能。为了验证ti
4+-imac-1微球用于imac吸附剂是可以被重复使用的，我们设计了一个10次循环的实验。将
10mg的ti
4+-imac材料作为循环使用的吸附剂，每次都富集10μg的β-酪蛋白酶解液，富集过程完成后，用碱性溶液将富集到吸附剂上的磷酸肽洗脱下来后，再用酸性上样溶液进行酸化平衡，然后进入下一轮的富集实验，如此进行10次循环实验。结果如图5c所示。在重复使用的过程中，从β-酪蛋白酶解液中富集到的三条特征肽段的信号值并没有明显的下降趋势，说明ti
4+-imac-1材料具有良好的重复使用性。
[0039]
按照质量比为1:100将β-酪蛋白和牛血清白蛋白混合酶解液作为富集样品，进一步考察材料对磷酸肽的特异性。如图6a所示，富集前由于磷酸肽的丰度太低，信号都被非磷酸肽的信号掩盖，富集后(图6b)，仅有三条特征的磷酸肽及它们的去磷酸碎片峰的信号可以清晰地被观察到，这说明实施例1中合成的ti
4+-imac-1功能材料对复杂样品中的磷酸肽具有很高的选择性。
[0040]
实施例2基于邻苯三酚配体的可重复使用的ti
4+-imac-2功能材料用于磷酸肽的分离富集
[0041]
可重复使用的ti
4+-imac-2功能材料的制备：
[0042]
(1)带有环氧官能团的聚合物微球的制备：先将0.4g的聚乙烯醇加入到40ml水-甲苯的混合溶剂中(水/甲苯＝5/2，体积比)，在100rpm的机械搅拌下，升温到80℃使其完全溶解后再冷却至室温；然后逐滴加入0.5ml甲基丙烯酸缩水甘油酯和4.0ml二缩三丙二醇二丙烯酸酯，接着加入60mg的过氧化苯甲酰，以60rpm的搅拌速率进行机械搅拌，2h后升温至80℃，继续反应2h后停止加热；产物依次用乙醇和水为洗涤剂进行洗涤，60℃真空干燥6小时，得到带有环氧官能团的聚合物微球；
[0043]
(2)邻苯三酚功能化的聚合物微球的制备同实施例1；
[0044]
(3)ti
4+-imac-2功能材料的制备：同实施例1。
[0045]
以ti
4+-imac-2功能材料为imac吸附剂对磷酸化肽的富集与鉴定过程同实施例1。
[0046]
材料表征
[0047]
图7为ti
4+-imac-2功能材料的扫描电镜图。从图中可以看出，所得材料为球形，直径100～150μm，表面含有大孔结构。氮气吸附/脱附实验结果，该材料比表面积为96mg2/cm，介孔主要分布在52nm附近。与实施例1相比，微球的直径有所增加，这可能与微球基质聚合时搅拌速度降低有关。
[0048]
材料应用
[0049]
图8a为ti
4+-imac-2功能材料对β-酪蛋白酶解液第一次富集后的maldi-tof-ms图。从图中看出，富集后虽然非磷酸肽的信号峰基本消失，但是同实施例1中的ti
4+-imac-1相比，磷酸肽的信号强度急剧下降。这可能是因为ti
4+-imac-2功能材料制备基质(带有环氧官能团的聚合物微球)中，环氧官能团的含量下降(制备时，环氧功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯的投入量为实施例1的1/4)，导致后续可供钛离子螯合修饰的位点减少，因此对磷酸肽的富集效率降低。尽管如此，该材料依然可以进行重复使用，10轮实验后，富集到的三条特征磷酸肽的峰强度没有明显下降的趋势。
[0050]
对比例 商品化imac微球用于磷酸化肽的分离富集
[0051]
imac微球材料螯合钛：按照厂家说明书使用方法，取1.0g商品化imac微球(商品名：spe-ti-imac，购自百灵威科技有限公司)，按1：100的比例与100g硫酸钛在水溶液中进行螯合12h，依次用10ml含有0.1％tfa、200mm nacl的水溶液和去离子水洗净残余的钛离
子，50℃真空干燥6h，得到商品化的imac材料。
[0052]
商业化ti-imac材料富集磷酸化肽：磷酸肽富集与质谱鉴定过程同实施例1。
[0053]
对了进行对比，从百灵威科技有限公司购买的商品名为spe-ti-imac的材料作为imac的吸附剂在同等条件下也对10μg的β-酪蛋白酶解液中的磷酸肽进行了富集。图9a为第一次富集后的maldi-tof分析质谱图。从图中可以看出，虽然该材料也可富集到β-酪蛋白酶解液中三条特征的磷酸肽，但是非磷酸肽的信号干扰依然不能忽略，这说明其富集效率不如实施例1中制备的ti
4+-imac-1材料高。第一次富集完成后，spe-ti-imac材料重新用酸性上样液平衡后也被再次用作吸附剂进行第二轮实验，结果如图9b表示。图中显示在第二轮实验中没有富集到任何磷酸肽，说明spe-ti-imac材料作为imac吸附剂只能使用一次，不能被重复利用。其原因是在磷酸肽的洗脱过程中，碱性洗脱液不仅可以破坏磷酸肽中磷酸基团与ti
4+
的螯合作用，同时也破坏了ti
4+
与吸附剂上磷酸配体之间的螯合作用，从而使磷酸肽从吸附剂上解离的同时，原先固定在吸附剂表面的ti
4+
也从吸附剂上解离。
[0054]
以上结果表明本发明所制备的以邻苯三酚为配体的ti
4+-imac功能材料，与商品化的spe-ti-imac材料相比对复杂样品中的磷酸肽具有更高的富集效率和选择性，而且可以被重复使用。本发明所采用的制备方法，操作简单，原料价廉易得，适合于大规模制备，其可重复利用的特性可极大地节约富集成本，符合“绿色环保”的理念。