一种微流控电阻抗血小板功能检测方法和采用该方法的微芯片与流程

1.本发明涉及医疗器械技术领域，具体地涉及一种微流控电阻抗血小板功能检测方法、采用该检测方法的微芯片及使用该微芯片的血小板检测装置。


背景技术：

2.缺血性疾病发病率、死亡率逐年增加，急性动脉血栓是我国疾病负担的重要因素。由血小板聚集功能异常可判断患者出血倾向疾病或血栓栓塞类疾病，因而及时、准确地评估血小板功能以便指导用药是必要的。此外，血小板除参与凝止血过程外，也可通过多种机制与白细胞、血管内皮细胞或平滑肌细胞等相互作用而在动脉粥样硬化、血管重塑、炎症过程中发挥重要作用，而目前尚缺乏对相应细胞或信号因子所致血小板聚集功能影响的研究。抗血小板药物为心脑血管疾病及其他动脉血栓性疾病治疗的一线用药，对标血小板黏附、信号传导、促凝等其他生理过程的抗板药物的研发与临床试验也是目前科研领域的热点。需注意的是，抗板药物的使用，尤其双联抗板药物的应用也会增加患者的出血风险。因此，临床上结合等基因测定及血小板功能检测的检验技术以评估抗板药物的疗效有望协助应用抗板药物的患者获得最大临床收益的同时减低出血等副作用发生的风险。
3.目前广泛应用的血小板功能检测的“金标准”为光学比浊法，但此方法需在中央实验室进行，对仪器设备及检验人员依赖度较高，需要两次离心分别获得富血小板血浆和乏血小板血浆，测得的血小板功能无法兼顾全血中其他细胞成分在人体生理环境下对血小板聚集过程的影响，且操作依赖离心机等仪器，同时需要磁力搅拌器、加热装置、光源及光学检测装置等，操作复杂，不易集成。为改善检测效果，现阶段临床及科研应用的血小板功能检测方法多为激活剂诱导血小板聚集的光学比浊法，但其具有依赖专业检验人员、需离心机等中心实验室设备辅助、无法评估其他外周血中细胞类型对血小板聚集功能的影响等缺点。光学比浊法对血小板活性指标的分析通常采用血小板聚集率来表征，其计算方法为：
[0004][0005]
其中prp指富血小板血浆，ppp指贫血小板血浆。由计算公式(1)可知，光学比浊法对血小板活性的评价需准备富血小板血浆、贫血小板血浆两种经过处理的样品作为基数，对待测血浆在加入促凝剂前后的透光度的变化进行分析。基于光学比浊法原理开发的verifynow系统通过覆盖有纤维蛋白原的珠子的设计缩减了离心过程而实现了仪器的小型化，通过简化分析方法verifynow系统对于血小板活性的表征为：
[0006][0007]
其中待测组为加入了对抗血小板药物靶点通道敏感的促凝剂的检测通道，对照组为加入了对抗血小板药物靶点通道不敏感的促凝剂的检测通道，通过分析这两个通道中血小板凝聚差异导致的透光度的成比例变化关系，可以说明所测样品对于该抗血小板药物治
疗效果。但此设备及检测器件系统复杂、价格高昂，未能在临床中大范围推广。
[0008]
血栓弹力图法通过监测血凝块形成过程中的粘弹性变化从而评估从血栓形成到溶解的整体止血功能。该方法以全血为标本，能提供一个直观的完整的血液凝集发生、发展和变化的过程。血栓弹力图法仍存在一定的局限性，如无法检测由血小板与血管内皮相互作用异常导致的血小板功能障碍(如尿毒症患者)；常规血栓弹力图采用凝血酶作为血小板激动剂，若患者已接受抗血小板治疗，则常规血栓弹力图就无法反映患者的凝血功能；目前尚缺乏统一的参考标准。
[0009]
连续血小板计数法(如plateletworks和pl-11等装置所采用的)通过对比电阻抗计数得到的未加诱聚剂前血液中血小板数量与加入诱聚剂后血小板数量的变化及血小板下降的速度评价血小板聚集率，其计算方法如下：
[0010][0011]
其优点在于结果来源于最直接的检测血小板聚集信息，检测标本采用全血而非血浆，这样样品基本保持了与体内血液的一致状态，且对小颗粒较为敏感，能很好地检测血小板数量。但这种方法需要高浓度促凝剂使样品中血小板充分凝集，且当血小板聚集率偏低时检测灵敏度不够。
[0012]
通过测量血小板聚集过程中电学性质的变化，可在无需离心的情况下检测全血中的血小板功能，且置入的电极为血小板的聚集过程提供了反应平面，较光学比浊法更贴近于体内血小板于受损内皮上的凝集过程，不受高血脂等影响光通过率的血液乳糜化等的影响。现已有multiplate实现血小板聚集过程的电阻抗分析，随着血小板的聚集，血小板会粘附在两根长度为3.2mm的镀银导电铜线上，使得测得的阻抗增加，其检测结果用聚集曲线下面积(auc，聚集单位(au)
×
分钟)表示。然而现有multiplate产品及其电阻抗血小板凝集分析方法对不同促凝剂的检测需进行分别加样，操作相对复杂。此外，该设备需磁力搅拌，且系统复杂，体积庞大，难以有效提升血小板功能分析的时效性和使用的便捷性。
[0013]
本发明将血小板的电阻抗检测方法与微流控技术相结合，具有样品用量少、检测速度快、体积微型化等特点，基于电阻抗法原理的多通道微流控血小板分析芯片可以实现“样品进，结果出”的集成化、自动化、便携化血小板功能分析，本发明提出一种适用于微流控电阻抗血小板功能分析的血小板凝集率计算方法，有助于实现单次测量中对单一血液样品(全血或富血小板血浆)的血小板功能的快速床旁检测，还能为临床抗血小板药物的使用提供参考。


技术实现要素：

[0014]
具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的技术问题：
[0015]
1.一种用于血小板检测的微芯片，其中所述微芯片包括相互连通的如下区域：
[0016]-样品入口区1，所述样品入口区1包括用于加入血液样品的进样口11和将进样口11分别与两个或多个储存腔室21连接的两个或多个进样流道12；
[0017]-试剂储存区2，所述试剂储存区2包括能够用于储存固体试剂的两个或多个储存腔室21；
[0018]-混合区3，所述混合区3包括用于将所述两个或多个储存腔室21分别与两个或多
个检测腔室41连接、并使所述血液样品与所述固体试剂在其中混合的两个或多个混合流道；
[0019]-检测区4，所述检测区4包括用于检测所述血液样品的血小板的两个或多个检测腔室41和设置于每个检测腔室41中的一对检测电极42；和
[0020]-样品出口，所述样品出口适于与提供负压的流体控制装置连接，
[0021]
其中所述储存腔室21中的至少一个包括预包埋的促凝剂，所述血液样品在所述储存腔室21中与所述促凝剂接触和/或混合，而且
[0022]
其中所述储存腔室21中的至少一个不包括预包埋的试剂，其作为空白对照。
[0023]
2.根据项1所述的微芯片，所述促凝剂包括对血小板凝集作用靶点敏感的促凝剂和对血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂。
[0024]
3.根据项1或2所述的微芯片，其包括至少三个进样流道和至少三个储存腔室，其中所述储存腔室中的第一储存腔室包括预包埋的对血小板凝集作用靶点敏感的促凝剂，其中所述储存腔室中的第二储存腔室包括预包埋的对所述血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂，其中所述储存腔室中的第三储存腔室不包括预包埋的试剂，其作为空白对照。
[0025]
4.根据项2或3所述的微芯片，其中所述血小板凝集作用靶点选自下组：环氧化酶(cox)、二磷酸腺苷(adp)受体、胶原受体、蛋白酶激活受体(par)、血小板活化因子(paf)和5-羟色胺(5-ht)受体。
[0026]
5.根据项4所述的微芯片，其中所述微芯片用于分析影响所述血小板凝集作用靶点的药物的抗血小板作用，其中所述药物选自下组：环氧化酶(cox)抑制剂、二磷酸腺苷(adp)受体抑制剂、胶原受体、蛋白酶激活受体(par)拮抗剂、血小板活化因子(paf)和5-羟色胺(5-ht)受体拮抗剂；所述环氧化酶(cox)抑制剂为血栓素a2(txa2)；优选所述二磷酸腺苷(adp)受体抑制剂为p2y12受体抑制剂。
[0027]
6.根据项4或5所述的微芯片，其中仅对所述环氧化酶(cox)敏感的促凝剂为花生四烯酸(aa)或血栓素a2(txa2)，仅对所述二磷酸腺苷(adp)受体敏感的促凝剂为二磷酸腺苷(adp)、仅对所述胶原受体敏感的促凝剂为胶原蛋白(col)、仅对所述血小板活化因子(paf)敏感的促凝剂为肾上腺素(adr)、仅对所述5-羟色胺(5-ht)受体敏感的促凝剂为5-羟色胺(5-ht)；对上述血小板凝集作用靶点均不敏感的促凝剂选自下组：凝血酶(thrombin)和凝血酶受体激活肽(trap)。
[0028]
7.根据项1-6中任一项所述的微芯片，其中所述检测电极42与外部的检测电路相连以检测各检测腔室中所述血液样品凝集产生的电信号，优选所述电信号是电阻抗信号，更优选检测电阻抗随时间的变化。
[0029]
8.根据项1-7中任一项所述的微芯片，其中所述样品出口设置在所述检测区4中；或者其中所述微芯片还包括废液区5，所述样品出口设置在所述废液区5中。
[0030]
9.根据项1-8中任一项所述的微芯片，其中所述进样流道12的个数为2-8个，优选3-6个，更优选4-5个，优选地其中所述进样流道12中的每一个的宽度和长度适于使每个流道的流阻相等。
[0031]
10.根据项1-9中所述的微芯片，其中
[0032]
所述储存腔室21为圆柱体或立方体腔室，优选所述储存腔室的高度为0.1-5毫米，优选所述圆柱体腔室的底面积的直径为1-10毫米或所述立方体腔室的底面积的长和/或宽
为1-10毫米；和/或
[0033]
所述检测腔室41为圆柱体或立方体腔室，优选所述检测腔室的高度为0.1-5毫米，优选所述圆柱体腔室的底面积的直径为0.5-10毫米或所述立方体腔室的底面积的长和/或宽为1-10毫米。
[0034]
11.根据项1-11中任一项所述的微芯片，其中所述混合流道为环型流道或具有一个或多个折返的s形流道，优选所述混合流道的高度和/或宽度为0.5-5毫米，优选地所述折返的个数为1-50个，优选5-20个，更优选10-15个，优选地每个所述折返的长度为0.5-20毫米，优选1-10毫米，优选地所述混合流道中设置有与所述血液样品流动方向呈夹角、相互间隔的多个挡板，优选所述夹角为15-165度，优选所述间隔的距离为0.1-1毫米。
[0035]
12.根据项1-11中任一项所述的微芯片，其中所述混合流道的内表面上设置有凸起，优选所述凸起的高度和/或宽度为所述混合流道的高度和/或宽度的10％-90％，更优选为20-80％，更优选为30％-70％。
[0036]
13.根据项1-12中任一项所述的微芯片，其中所述检测腔室41内设置有磁珠，所述磁珠能够通过磁场对进入所述检测腔室41的样品进行搅拌。
[0037]
14.根据项1-13中任一项所述的微芯片，，其中所述检测电极42为平面电极，优选所述平面电极已使用修饰材料进行了修饰，更优选所述修饰材料选自下组：纤维蛋白原、凝血酶原、牛血清蛋白、纤维粘连蛋白和胶原蛋白。
[0038]
15.根据项1-14中任一项所述的微芯片，其中所述废液区被配置为其体积不小于所述血液样品的体积的50％。
[0039]
16.根据项1-15中任一项所述的微芯片，其中所述微芯片中与所述血液样品接触的表面已使用表面改性材料进行了改性，优选所述表面改性材料是亲水性材料，更优选为共聚物水凝胶表面活性剂，更优选地选自下组：水杨酸衍生物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，纳米tio2，pegmem，aptes，3-氯丙基三氯硅烷，peg，brij-35，tween-20，f127，f108，f68和poly-hema。
[0040]
17.根据项1-16中任一项所述的微芯片，其中所述微芯片中除检测电极外的部分由选自下组的材料制成：聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚苯乙烯(ps)、环烯烃共聚物(coc)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚酰胺(pi)、环氧树脂、聚氨酯、硅和玻璃。
[0041]
18.根据项1-17中任一项所述的微芯片，其中所述检测电极由选自下组的材料制成：金、铂、碳基材料、银浆、镍、铝和铜，优选所述碳基材料选自下组：碳纳米管、石墨烯和碳浆。
[0042]
19.根据项1-18中任一项所述的微芯片，其中所述微芯片的整体尺度为(3-10)cm*(3-10)cm*(0.2-2.0)cm。
[0043]
20.根据项1-19中任一项所述的微芯片，其中所述微芯片能够在加入样品后的15分钟内、优选10分钟内、更优选5分钟内提供血小板检测的结果。
[0044]
21.一种与根据项1-20中任一项所述的微芯片适配的外部装置，所述外部装置包括：
[0045]
用于装配所述微芯片的接口；
[0046]
流体控制装置，当所述微芯片通过所述接口与所述外部装置适配时，所述流体控
制装置与所述微芯片的样品出口连接并向所述微芯片提供负压；
[0047]
检测分析装置，当所述微芯片通过所述接口与所述外部装置适配时，所述检测分析装置对所述检测电极42检测到的电阻抗进行记录和分析以得到检测结果；
[0048]
输出装置，所述输出装置用于显示检测结果；和
[0049]
任选的当所述微芯片通过所述接口与所述外部装置适配时，能够在检测腔室41外部提供磁场的元件。
[0050]
22.一种用于血小板检测的系统，其包括：
[0051]
(a)根据项1-20中任一项所述的微芯片；和
[0052]
(b)根据项21所述的外部装置，
[0053]
其中所述微芯片被适配在所述外部装置上。
[0054]
23.一种用于血小板检测的方法，其包括：
[0055]
(a)将根据项1-20中任一项的微芯片装配于项21所述的外部装置上，或者提供根据项22所述的系统；
[0056]
(b)将样品加入所述微芯片的样品入口区1的进样口11；
[0057]
(c)所述外部装置中的输出装置读取血小板检测的结果；和
[0058]
任选地在步骤(b)之前、之后或同时，在检测腔室41外部提供磁场。
[0059]
24.根据项23所述的方法，其还包括：
[0060]
对所述检测电极42检测到的电阻抗信号绘制时间-电阻曲线，并计算包埋试剂的时间-电阻曲线与空白对照的时间-电阻曲线两者曲线下面积的差值，从而得到随时间变化的差分曲线下面积，其用于表征血小板在影响血小板凝集作用靶点的药物作用下的凝集效果。
[0061]
25.根据项23或24所述的方法，其中所述样品是血液样品或富血小板血浆样品，优选为人的血液样品或富血小板血浆样品，更优选已施用抗血小板药物的人的血液样品，甚至更优选所述影响血小板凝集作用靶点的药物选自下组：阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛、坎格瑞洛、依诺格雷、噻氯匹啶、阿昔单抗、埃替非巴肽、替罗非班、西洛他唑、双嘧达莫、普拉格雷、阿加曲班、阿那格雷、奥扎格雷、前列环素、沙格雷酯和依替巴肽。
[0062]
26.根据项25所述的方法，其中所述血液样品是已施用p2y12受体抑制药物的人的血液样品，更优选所述p2y12受体抑制药物选自下组：氯吡格雷、替格瑞洛、坎格瑞洛、依诺格雷、噻氯匹啶和普拉格雷。
[0063]
为使本发明所述用于血小板检测的微芯片的技术方案更加清晰，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进行进一步的说明。
附图说明
[0064]
图1所示为本发明所述的血小板功能检测芯片的结构示意图；
[0065]
图2所示为本发明所述的血小板功能检测芯片的剖面示意图；
[0066]
图3所示为本发明所述的血小板功能检测芯片中混合流道的横切面示意图，其中箭头指示血液样品流动方向，α指示挡板与样品流动方向的夹角，d指示挡板之间的间隔；
[0067]
图4所示为本发明所述的血小板功能检测芯片中检测区部分的放大图；
[0068]
图5显示采用本发明述的微芯片检测血小板功能的数据结果，其中“adp”为一种血
小板激活剂，“control”为对照，本方法所得结果可以用两者随时间变化的电阻抗曲线下面积差值表示。
[0069]
图6a和图6b显示本发明所述的微流控电阻抗血小板检测方法的数据结果，其中aa与adp均为血小板促凝剂(其中，aa代表对p2y12受体抑制剂不敏感的促凝剂；而adp代表对p2y12受体抑制剂敏感的促凝剂)，control为对照，本方法所得每种促凝剂下血小板凝集结果可以分别用其与对照之间随时间变化的电阻抗曲线下面积差值表示；aa与adp之间的差异可以用来指示特异于某个血小板凝集作用靶点(例如p2y12受体抑制剂)的药物(例如氯吡格雷)对受试者中血小板聚集功能抑制的效果。
[0070]
其中，附图标记为：
[0071]
1-样品入口区，11-进样口，12-分支流道；
[0072]
2-试剂储存区，21-圆形腔室，22-连通圆形腔室与样品入口区的管道，23-连通圆形腔室与混合区的管道；
[0073]
3-混合区，31-挡板；32-混合流道
[0074]
4-检测区，41-检测腔室，42-检测电极，43-电极垫，44-样品出口。
[0075]
发明详述
[0076]
1.本发明的微芯片
[0077]
在一个方面，本发明提供一种血小板功能检测芯片，该芯片以微流控技术为基础，通过微管道结构设计，将临床血液或血浆样品与试剂高效混合从而激活样品中的血小板，通过对样品电阻抗的实时监测与分析评估血小板活化功能。该微流控芯片设置有多个通道，可对多种血小板凝集因素进行同步检测，且在芯片上自设对照组。
[0078]
在一个实施方案中，本发明的微流控芯片包括如下区域：样品入口区、试剂储存区、混合区、检测区和样品出口。在一个实施方案中，本发明的微流控芯片包括的区域是相互连通的。在一个实施方案中，所述样品入口区包括用于加入血液样品的进样口和将进样口分别与两个以上(例如两个、三个、四个或更多个)储存腔室连接的两个以上(例如两个、三个、四个或更多个)进样流道。在一个实施方案中，所述试剂储存区包括能够用于储存固体试剂的两个以上(例如两个、三个、四个或更多个)储存腔室。在一个实施方案中，所述混合区包括两个以上(例如两个、三个、四个或更多个)混合流道，所述混合流道用于将两个以上(例如两个、三个、四个或更多个)储存腔室分别与两个以上(例如两个、三个、四个或更多个)检测腔室连接，并使所述血液样品与所述固体试剂在所述流道中混合。在一个实施方案中，所述检测区包括用于检测所述血液样品的血小板的两个以上(例如两个、三个、四个或更多个)检测腔室和设置于每个检测腔室中的一对检测电极。在一个实施方案中，本发明的微流控芯片还包括样品出口，所述样品出口适于与提供负压的流体控制装置连接。在一个实施方案中，储存腔室中的至少一个包括预包埋的促凝剂。在一个实施方案中，血液样品在储存腔室中与所述促凝剂接触和/或混合。在一个实施方案中，储存腔室中的至少一个不包括预包埋的试剂，其作为空白对照。
[0079]
在一个实施方案中，本发明的微流控芯片中的储存腔室中预包埋的促凝剂包括对血小板凝集作用靶点敏感的促凝剂和所述对血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂。在一个实施方案中，本发明的微流控芯片包括至少三个进样流道和至少三个储存腔室，其中所述储存腔室中的第一储存腔室包括预包埋的对血小板凝集作用靶点敏感的促凝剂，其中所述
储存腔室中的第二储存腔室包括预包埋的对所述血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂，其中所述储存腔室中的第三储存腔室不包括预包埋的试剂，其作为空白对照。在一个实施方案中，本发明的微流控芯片包括至少三个进样流道和至少三个储存腔室，其中所述储存腔室中的第一储存腔室包括预包埋的仅对血小板凝集作用靶点i敏感而对其他血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂，所述储存腔室中的第二储存腔室包括预包埋的仅对所述血小板凝集作用靶点ii敏感而对其他血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂，且所述储存腔室中的第三储存腔室不包括预包埋的试剂，其作为空白对照。在一个实施方案中，本发明的微流控芯片包括至少四个进样流道和至少四个储存腔室，其中所述储存腔室中的第一储存腔室包括预包埋的仅对血小板凝集作用靶点i敏感而对其他血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂，所述储存腔室中的第二储存腔室包括预包埋的仅对所述血小板凝集作用靶点ii敏感而对其他血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂，所述储存腔室中的第三储存腔室包括预包埋的仅对所述血小板凝集作用靶点iii敏感而对其他血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂，且所述储存腔室中的第四储存腔室不包括预包埋的试剂，其作为空白对照。
[0080]
在一个实施方案中，本发明的血小板凝集作用靶点选自下组：环氧化酶(cox)、二磷酸腺苷(adp)受体、胶原受体、蛋白酶激活受体(par)、血小板活化因子(paf)和5-羟色胺(5-ht)受体。
[0081]
在一个实施方案中，本发明的微芯片用于分析影响所述血小板凝集作用靶点的药物的作用效果，其中所述药物选自下组：环氧化酶(cox)抑制剂、二磷酸腺苷(adp)受体抑制剂、胶原受体、蛋白酶激活受体(par)拮抗剂、血小板活化因子(paf)和5-羟色胺(5-ht)受体拮抗剂。在一个实施方案中，环氧化酶(cox)抑制剂为血栓素a2(txa2)。在一个实施方案中，所述二磷酸腺苷(adp)受体抑制剂为p2y12受体抑制剂。
[0082]
在一个实施方案中，仅对所述环氧化酶(cox)敏感的促凝剂为花生四烯酸(aa)或血栓素a2(txa2)，仅对所述二磷酸腺苷(adp)受体敏感的促凝剂为二磷酸腺苷(adp)，仅对所述胶原受体敏感的促凝剂为胶原蛋白(col)，仅对所述血小板活化因子(paf)敏感的促凝剂为肾上腺素(adr)，仅对所述5-羟色胺(5-ht)受体敏感的促凝剂为5-羟色胺(5-ht)。在一个实施方案中，对上述血小板凝集作用靶点均不敏感的促凝剂选自下组：凝血酶(thrombin)和凝血酶受体激活肽(trap)。
[0083]
在一个实施方案中，本发明的微流控芯片包括四个进样流道和至少四个储存腔室，其中第一储存腔室预包埋花生四烯酸(aa)，第二储存腔室预包埋二磷酸腺苷(adp)，第三储存腔室预包埋凝血酶(thrombin)，第四储存腔室不包埋试剂作为空白对照。
[0084]
在一个实施方案中，检测电极与外部的检测电路相连以检测各检测腔室中所述血液样品凝集产生的电信号。在一个实施方案中，所述电信号是电阻抗信号。在一个实施方案中，所述电信号是电阻抗随时间的变化。
[0085]
在一个实施方案中，样品出口设置在所述检测区中。在一个实施方案中，本发明的微流控芯片还包括废液区，所述样品出口设置在所述废液区中。
[0086]
在一个实施方案中，在样品进入本发明的微流控芯片的样品入口区后，分流至两个或更多个进样流道，并依次流过试剂储存区、混合区和检测区。在一个实施方案中，在样品经过本发明的微流控芯片的检测区后，残余的样品在废液区收集。
[0087]
在一个实施方案中，样品入口区包含多个进样流道以实现多通道同时检测。在一
个实施方案中，所述进样流道的个数为2-8个，优选3-6个，更优选4-5个。在一个实施方案中，所述进样流道中的每一个的宽度和长度经设计以适于使每个流道的流阻相等。在一个实施方案中，样品从进样口进入各进样流道后经过相同时间进入试剂储存区。
[0088]
在一个实施方案中，储存腔室为圆柱体或立方体腔室。在一个实施方案中，储存腔室的高度为0.1-5毫米。在一个实施方案中，圆柱体腔室的底面积的直径为1-10毫米。在一个实施方案中，立方体腔室的底面积的长和/或宽为1-10毫米。在一个实施方案中，样品进入储存腔室的入口和样品离开储存腔室的出口分别位于储存腔室对角位置，从而促进样品与预包埋的试剂充分接触和混合，使得试剂更均匀地分散在样品中。
[0089]
在一个实施方案中，混合流道为环形流道或具有一个或多个折返的s形长流道。在一个实施方案中，所述混合流道的高度和/或宽度为0.5-5毫米。在一个实施方案中，所述折返的个数为1-50个，优选5-20个，更优选10-15个。在一个实施方案中，每个所述折返的长度为0.5-20毫米，优选1-10毫米。在一个实施方案中，所述混合流道中设置有与所述血液样品流动方向呈夹角、相互间隔的多个挡板。在一个实施方案中，所述夹角α为15
°‑
165
°
，优选30
°‑
150
°
，更优选45
°‑
145
°
，更优选60
°‑
120
°
。在一个实施方案中，所述间隔的距离为0.1-1毫米，优选0.2-0.8毫米，更优选0.3-0.5毫米。在一个实施方案中，所述其中所述混合流道的内表面上设置有凸起。在一个实施方案中，混合流道的内表面上凸起的高度和/或宽度为所述混合流道的高度和/或宽度的10％-90％，更优选为20-80％，更优选为30％-70％，更优选为40-60％。
[0090]
在一个实施方案中，检测腔室为圆柱体或立方体腔室，在一个实施方案中，检测腔室的高度为0.1-5毫米。在一个实施方案中，圆柱体腔室的底面积的直径为0.5-10毫米。在一个实施方案中，立方体腔室的底面积的长和/或宽为1-10毫米。在一个实施方案中，所述检测腔室内设置有磁珠，所述磁珠能够通过磁场对进入所述检测腔室的样品进行搅拌。在一个实施方案中，所述检测腔室的底部区域设有一对平面电极。在一个实施方案中，所述平面电极通过导线与外部的检测电路相连以对所述血液样品凝固的电信号进行检测。在一个实施方案中，所述平面电极通过导线经由电极垫与外部的检测电路相连以对所述血液样品凝固的电阻抗信号进行实时检测。在一个实施方案中，为加速血小板凝集、改善电阻抗检测效果或提高电极的稳定性，所述平面电极已使用修饰材料进行了修饰。在一个实施方案中，所述修饰材料选自下组：纤维蛋白原、凝血酶原、牛血清蛋白、纤维粘连蛋白和胶原蛋白。
[0091]
在一个实施方案中，废液区为一个整体的大型腔室，各通道的液体均可流入废液区收集。在一个实施方案中，废液区尺寸根据待检测样品体积具体确定。在一个实施方案中，废液区的体积被配置为不小于所述血液样品的体积的50％。在一个实施方案中，废液区设有1个出口，所述出口与微泵等流体控制装置连通以向所述微芯片提供负压，从而将样品从进样口吸入直至完全充满检测区并有少量液体进入废液区。
[0092]
在一个实施方案中，本发明的微芯片中与血液样品接触的表面已使用表面改性材料进行了改性。在一个实施方案中，所述表面改性材料是亲水性材料。在一个实施方案中，所述表面改性材料是共聚物水凝胶表面活性剂。在一个实施方案中，所述表面改性材料选自下组：水杨酸衍生物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，纳米tio2，pegmem，aptes，3-氯丙基三氯硅烷，peg，brij-35，tween-20，f127，f108，f68，poly-hema。
[0093]
在一个实施方案中，本发明的微芯片中除检测电极外的部分由选自下组的材料制
成：聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚苯乙烯(ps)、环烯烃共聚物(coc)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚酰胺(pi)、环氧树脂、聚氨酯、硅和玻璃。在一个实施方案中，检测电极由选自下组的材料制成：金、铂、碳基材料、银浆、镍、铝和铜。在一个实施方案中，所述碳基材料选自下组：碳纳米管、石墨烯和碳浆。然而，用于本发明所述的芯片和电极的材料不局限于此，现有可用于制备芯片或电极的材料均可适用于本发明。
[0094]
在一个实施方案中，本发明的微芯片集成度高，小巧便携。在一个实施方案中，所述微芯片的整体尺度为(3～10)cm*(3～10)cm*(0.2～2.0)cm。在一个实施方案中，本发明的微芯片能够实现临床血液或血浆样品中血小板功能的快速、准确、便捷、集成、自动化检测。在一个实施方案中，所述微芯片能够在加入样品后的15分钟内、优选10分钟内、更优选5分钟内提供血小板检测的结果。
[0095]
2.与本发明的微芯片适配的外部装置
[0096]
在一个方面，本发明还提供一种与本发明的微芯片适配的外部装置。在一个实施方案中，所述外部装置包括：用于装配所述微芯片的接口、流体控制装置、检测分析装置和输出装置。在一个实施方案中，流体控制装置被配置成当所述微芯片通过所述接口与所述外部装置适配时，所述流体控制装置与所述微芯片的样品出口连接并向所述微芯片提供负压。在一个实施方案中，检测分析装置被配置成当所述微芯片通过所述接口与所述外部装置适配时，所述检测分析装置对所述检测电极检测到的电阻抗进行记录和分析以得到检测结果。在一个实施方案中，输出装置被配置成显示检测结果，其可为显示器或打印机。在一个实施方案中，本发明的外部装置进一步包括：当所述微芯片通过所述接口与所述外部装置适配时，能够在检测腔室41外部提供磁场的元件。
[0097]
3.本发明用于血小板检测的系统
[0098]
在一个方面，本发明还提供一种用于血小板检测的系统。在一个实施方案中，所述系统包括：(a)本发明的微芯片；和(b)本发明的外部装置。在一个实施方案中，所述系统中的微芯片被适配在外部装置上。
[0099]
4.本发明用于血小板检测的方法
[0100]
在一个方面，本发明提供一种适用于微流控电阻抗血小板功能分析的血小板凝集率计算方法，有助于实现单次测量中对单一血液样品(全血或富血小板血浆)的血小板功能的快速床旁检测，从而为临床抗血小板药物的使用提供参考。本发明用于血小板检测的方法可以对血小板凝集过程中电阻抗的变化进行实时动态的监控，尤其是用于分析抗血小板药物对血小板凝集的影响，以此作为参考优化抗血小板药物的正确使用。所述抗血小板药物包括但不限于阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛、坎格瑞洛、依诺格雷、噻氯匹啶、阿昔单抗、埃替非巴肽、替罗非班、西洛他唑、双嘧达莫、普拉格雷、阿加曲班、阿那格雷、奥扎格雷、前列环素、沙格雷酯和依替巴肽等。
[0101]
在一个实施方案中，本发明用于血小板检测的方法包括如下步骤：(a)将本发明的微芯片装配于本发明的外部装置上或者提供本发明的系统；(b)将血液样品加入所述微芯片的样品入口区的进样口；和(c)所述外部装置中的输出装置读取血小板检测的结果。在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括：在步骤(b)之前、之后或同时，在检测腔室41外部提供磁场。
[0102]
在一个实施方案中，本发明用于血小板检测的方法还包括：对所述检测电极检测到的电阻抗信号绘制时间-电阻曲线，并计算流过包埋有试剂的储存腔室的样品的时间-电阻曲线与空白对照(流过未包埋试剂的储存腔室的样品)的时间-电阻曲线两者曲线下面积的差值，从而得到随时间变化的差分曲线下面积，将其用于表征血小板在所述促凝剂作用下的凝集效果。
[0103]
在一个实施方案中，本发明用于血小板检测的方法中使用的血液样品是人的血液样品，优选已施用抗血小板药物的人的血液样品。在一个实施方案中，所述抗血小板药物选自下组：阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛、坎格瑞洛、依诺格雷、噻氯匹啶、阿昔单抗、埃替非巴肽、替罗非班、西洛他唑、双嘧达莫、普拉格雷、阿加曲班、阿那格雷、奥扎格雷、前列环素、沙格雷酯和依替巴肽。在一个实施方案中，所述血液样品是已施用p2y12受体抑制药物的人的血液样品。在一个实施方案中，所述p2y12受体抑制药物选自下组：氯吡格雷、替格瑞洛、坎格瑞洛、依诺格雷、噻氯匹啶和普拉格雷。
[0104]
在一个实施方案中，血液样品或富血小板血浆样品(例如枸橼酸盐抗凝管收集的静脉血)通过样品入口流道分流进入各个试剂储存区，与促凝剂等混合后，经混合区转移到检测区，通过特别管道设计使得待测样品与各个通道的试剂充分混合，并转移到检测区测量其各个通道待测样品电阻抗的变化。
[0105]
在一个实施方案中，对每个通道测量样品电阻抗随时间的变化情况，并记录时间-电流曲线。分别将包埋有试剂组的时间-电阻曲线与未包埋试剂的空白对照的时间-电阻曲线绘制在一起，并计算两条曲线的曲线下面积的差值，得到随时间变化的差分曲线下面积，以反映血小板在该促凝剂作用下的凝集效果，此计算方法称为差分曲线下面积法(differential auc，dauc)。
[0106]
在一个实施方案中，在本发明的微芯片和检测方法中，同时包含有对待测药物影响的血小板凝集作用靶点敏感的促凝剂的反应单元，和对待测药物影响的血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂的反应单元。在一个实施方案中，第一储存腔室预包埋二磷酸腺苷(adp)，可以用来评估p2y12受体抑制药物(包括但不限于氯吡格雷、替格瑞洛、坎格瑞洛、依诺格雷、噻氯匹啶和普拉格雷)抑制血小板凝集的情况。在一个实施方案中，第二储存腔室预包埋对p2y12不敏感的促凝剂，如凝血酶(thrombin)，凝血酶受体激活肽(trap)等。由此，将含有对待测药物影响的血小板凝集作用靶点敏感的促凝剂的反应单元中的时间-电阻曲线和含有对待测药物影响的血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂的反应单元中的时间-电阻曲线绘制在一起比较，按照前面的说明计算随时间变化的差分曲线下面积，从而可以有选择性地分析：相对于检测对象的血小板聚集功能的基线，影响特定血小板凝集作用靶点的药物(例如p2y12受体抑制药物，其包括但不限于氯吡格雷、替格瑞洛、坎格瑞洛、依诺格雷、噻氯匹啶和普拉格雷)对受试者血小板聚集功能抑制的作用。
[0107]
5.本发明的优势
[0108]
本发明的微芯片将反应试剂以固体形式预先包埋在试剂储存区内，并通过样品流体的运动对试剂溶解与混合，显著降低系统复杂度，提高芯片保存期。本发明的微芯片可实现样品与预包埋试剂的高效混合，一方面试剂储存区中的入口和出口设计使预包埋试剂均匀分散且开始混合；另一方面混合区通过具有一个或多个折返的s形流道和流道中与样品流动方向呈夹角、相互间隔的多个挡板的设计进一步提高了混合效率；而且检测区还可以
通过设置在磁场下转动的磁珠对进入所述检测腔室的样品进行更充分搅拌。本发明的微芯片通过测定电阻抗对血小板凝集过程进行实时分析。
[0109]
本发明提供了一种新型血小板功能检测方法，其基于芯片上自带对照，通过计算实验组和对照组血小板凝集曲线的曲线下面积之差进行检测。本发明的检测方法能够更准确地反应血小板功能及受抗血小板药物的影响，消除了批间误差、样本误差与检测环境带来的干扰。本发明的微流控芯片实现了临床血液或血浆样品中血小板功能的快速、准确、便捷、集成、自动化检测以及多通道电阻抗式血小板凝集功能分析，一次实验可获得同一样本的多个参数，为实现血小板功能床旁检测奠定了基础。本发明可以设置对待测血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂的反应单元作为检测对象的血小板聚集功能的基线，从而评价抗血小板药物的真实效果。本发明的检测方法操作简单、计算简便，可以实时动态呈现检测结果。此外，本发明的检测方法与微流控电阻抗血小板功能分析芯片有机结合，有助于实现便携式、自动化的血小板功能poct检测。
[0110]
因此，本发明的微流控芯片至少具有如下技术优势：
[0111]
(1)多参数，可以在一次实验中获取多个指标；
[0112]
(2)结果准，电阻式检测接近生理过程，自带对照，排除样本与环境误差干扰；
[0113]
(3)易操作，计算方法简洁，操作流程简便；
[0114]
(4)样本少，一个微流控芯片仅需不到1ml外周血即可完成多参数快速检验；
[0115]
(5)集成高，可自动化控制，不依赖检验人员；和/或
[0116]
(6)扩展强，可按照临床需要在芯片上设计多种检测指标同步检测。
具体实施方式
[0117]
下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施例并不能被理解为是对本发明保护范围的限制。本领域技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可对这些具体实施例作出多种变更或修改，所述变更和修改后的实施方案仍落入本发明的保护范围。
[0118]
本实施方式提供了一种微流控电阻抗血小板检测方法和采用所述方法的微流控芯片，其具体实施方式包括如下：
[0119]
本发明提供了采用本发明的血小板检测方法的微流控芯片，该芯片包括：
[0120]
样品入口区1，其主体为进样口11与分支流道12。所述进样口一端开放，所测试的生物样品通过移液枪等方式加入进样口中，另一端连接分支流道从而进入下游流道。各分支流道通过调节流道长度与宽度，使得各分支流道流阻相等，样品通过分支流道进入试剂储存区所需时间相等；
[0121]
试剂储存区2，包含储存固体试剂的圆形腔室21，以及位于对角线位置分别连通入口区与混合区的管道22和管道23。固体试剂预包埋在圆形腔室中，从而样品进入后会使固体试剂溶解并开始混合。对于圆形腔室来说，对角线设置进出口的设计可以促进样品与预包埋的固体试剂充分接触混合，固体试剂分散的更均匀；
[0122]
混合区3，包含多段弯曲流道，流道内设置阵列式排列的挡板31。挡板与流道内液体运动方向夹角为15-90度，使得原来层流运动的样品与试剂混合液在挡板处形成湍流，从而加速混合。挡板在流道内成阵列式排布，以一定的间距重复出现，挡板间距范围为0.1-1
毫米。在混合区弯曲流道重复出现，样品与试剂混合液在混合区经过5-20段弯曲流道，从而极大提高了样品与试剂混合时间，使试剂均匀分散在样品中且充分反应，从而使血小板得到充分的激活；
[0123]
检测区4，包含有平行排布的检测腔室41，以及每个检测腔室内放置的一对检测电极42。所述检测腔室可以为圆形或方形，样品与试剂混合液完全充满检测腔室并略有溢出流到下游。所述平面电极通过电极垫43连接外围检测电路，从而通过电阻抗测试进行样品中血小板功能分析。样品出口44连通微泵等流体控制装置，提供吸力将液体从样品入口驱动到检测区；和
[0124]
废液区5。
[0125]
本发明的微芯片包含多个通道，样本进入芯片后在样本入口流道分流至各个通道，并在各个通道依次流过试剂储存区、混合区和检测区，多余液体在废液区收集。该微流控芯片包含至少2个及以上的通道。在不同通道的试剂储存区中分别包埋有不同的反应试剂，包括而不限于对待测血小板凝集作用靶点敏感的促凝剂，对待测血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂，空白对照，及其他影响血小板凝集的试剂和材料。这里所提的促凝剂包括但不限于花生四烯酸(aa)、二磷酸腺苷(adp)、胶原蛋白(col)、血栓素a2(txa 2)、肾上腺素(adr)、5-羟色胺(5-ht)。在一个实施例中，通道a的储存腔室预包埋花生四烯酸(aa)，通道b的储存腔室预包埋二磷酸腺苷(adp)，通道c的储存腔室预包埋凝血酶(thrombin)，通道d的储存腔室预先不包埋任何试剂作为空白对照。
[0126]
血液样本或富血小板血浆样本(在一个实施例中为枸橼酸盐抗凝管收集的静脉血)通过样本入口流道分流进入各个试剂储存区，与促凝剂等混合后，经混合区转移到检测区，通过特别管道设计使得待测样本与各个通道的试剂充分混合，并转移到检测区测量其各个通道待测样本电阻抗的变化。
[0127]
对每个通道测量样本电阻抗随时间动态变化情况，并记录时间-电流曲线。分别将包埋有试剂组的时间-电阻曲线与未包埋试剂的空白对照的时间-电阻曲线绘制在一起，并计算两条曲线的曲线下面积的差值，得到随时间变化的差分曲线下面积，以反映血小板在该促凝剂作用下的凝集效果。
[0128]
本发明的方法中可以同时包括含有对待测药物影响的血小板凝集作用靶点敏感的促凝剂的反应单元，和含有对待测药物影响的血小板凝集作用靶点不敏感的促凝剂的反应单元。可以将上述两个反应单元中的时间-电阻曲线绘制在一起，并计算随时间变化的差分曲线下面积。基于此结果可以获得相对于受试者的血小板聚集功能的基线，影响特定血小板凝集作用靶点的药物(例如p2y12受体抑制药物，其包括但不限于氯吡格雷、替格瑞洛、坎格瑞洛、依诺格雷、噻氯匹啶和普拉格雷)对受试者血小板聚集功能的抑制效果。
[0129]
以上所述，仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。本领域的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可对上述披露的技术内容作出多种变更或修改，这些变更和修改均落入本发明的保护范围。