酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法与应用
【专利说明】酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法与应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及色谱固定相技术领域，具体地说，是一种酸性糖类化合物涂覆型亲水 色谱固定相的制备方法与应用。 【【背景技术】】
[0002] 色谱分离作为一种高效、快速的分离分析技术，被广泛应用于天然产物、食品卫 生、药品检测、生化分离以及环境检测等各个领域。高性能的色谱填料及固定相的发展是 各种分离模式赖以建立和发展的基础。色谱固定相作为色谱分离的核心，它的性质直接决 定色谱分离的选择性和分离效率。硅胶以其良好的机械强度、可控的多孔结构、较好的化 学稳定性等优点被广泛用于HPLC固定相应用。不同表面基团的键合硅胶可以应用于多种 不同的色谱分离模式。其中在硅胶表面修饰上各种类型的极性基团，可以的得到多种亲 水色谱固定相[P.Hemstrom，et al，J. Sep. 3(^，2006,29，1784]，因其分离模式对极性 化合物有很强的保留及很好的分离选择性，并且与质谱检测良好的兼容性和灵敏度，亲水 作用色谱及其固定相的发展与应用也越来越受到科研工作的青睐[Buszewski B，Noga S. Analytical and bioanalytical chemistry，2012,402,231]〇
[0003] 糖类化合物因其含有大量的羟基基团，可作为亲水作用色谱固定相理想的修饰单 元。硅胶表面的糖型固载方式较多，其中基于附聚型离子交换树脂制备原理发展的一种阳 离子多糖涂覆型亲水色谱固定相制备方法，即利用离子相互作用原理，将硅胶进行一定的 表面修饰使其带负电荷，再与阳离子多糖结合，以制备附聚型的阳离子多糖涂覆型亲水色 谱固定相。该固定相在极性化合物的分离以及糖肽/磷酸化肽的选择性富集都具有较好的 效果[Qianying Sheng，et al，J. Chromatogr. A，2013，1291，56]〇
[0004] 基于以上的研究背景及固定相设计与制备思路，发明人开发出了一种新型的亲水 色谱固定相及其制备方法，同样利用离子相互作用原理，将硅胶进行一定的表面修饰使其 带正电荷，再与带负电荷的酸性糖类化合物结合，以制备一种新型的酸性糖类化合物涂覆 型亲水色谱固定相。此方法优势在于反应简单易控，稳定性高，在水系中涂覆更为环保安 全。同时在色谱分离及修饰蛋白质组学中都取得了很好的应用前景。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种酸性糖类化合物涂覆型亲水色 谱固定相的制备方法与应用。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007] -种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相，其化学结构式为：
[0008]
[0009] 其中Silica Gel为硅胶，经表面修饰后带正电荷，糖类化合物为酸性单糖、酸性寡 糖或酸性多糖，带负电荷。
[0010] -种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其具体步骤为：
[0011] (1)硅胶预处理
[0012] 硅胶加入质量浓度为1~40%的盐酸或硝酸溶液中，加热回流搅拌1~48小时， 过滤，水洗至中性，于100~160°C下干燥至恒重；
[0013] (2)硅胶表面修饰
[0014] 将步骤（1)所得的活化硅胶置于玻璃或者聚四氟乙烯反应容器中，在氮气氛围 下加入有机溶剂，搅拌均匀，滴加硅烷试剂，保持温度为20~200°C条件下搅拌2~48小 时。待反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲苯、丙酮、甲醇水、甲醇洗涤，固体产品在60~ l〇〇°C条件下干燥12~36小时；
[0015] 所述的有机溶剂为与水不互溶的有机溶剂，包括甲苯、乙苯、二甲苯、正己烷、正庚 烷、正戊烷、正辛烷、环己烷等苯系物和烷烃；
[0016] 所述的有机溶剂的使用量为每克活化硅胶使用2~IOOmL有机溶剂；硅烷试剂结 构式为：
[0018] 其中，X为-0CH3, -OCH2CH3或-Cl，m = 1~12, A为-Cl ;硅烷试剂的使用量为每 克活化硅胶使用〇. 5~5mmol ;
[0019] (3)硅胶表面带电修饰
[0020] 将步骤（2)所得产品分散于乙腈溶液中，再加入N-甲基咪唑及相转移催化剂，搅 拌均匀，保持温度为20~200°C条件下搅拌2~48小时；反应结束后减压过滤并用二氯甲 烷、甲醇洗涤，固体产品在60~100°C条件下干燥12~36小时；
[0021] 所述的硅胶分散溶液的使用量为每克硅胶分散于2~IOOmL乙腈溶液，加入 0. 1~Ig N-甲基咪唑及0. 01~0.1 g相转移催化剂；
[0022] 所述的相转移催化剂为常用的季铵盐相转移催化剂，包括苄基三乙基氯化铵 (TEBA)、四丁基碘化铵（TBAI)、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、四丁基硫酸氢铵（TBAB)、三 辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵等；
[0023] ⑷涂覆过程
[0024] 将步骤（3)所得产品与酸性糖类化合物水溶液混合，搅拌均匀，保持温度为10~ 80°C条件下搅拌1~60分钟；反应结束后减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在60~ 100°C条件下干燥12~36小时。
[0025] 所述的酸性糖类化合物为酸性单糖、酸性寡糖或酸性多糖等，包括葡萄糖醛酸、海 藻酸钠寡糖、卡拉胶寡糖、卡拉胶多糖等等，分子量范围在100~200万之间；
[0026] 所述的酸性糖类化合物的使用量为每克硅胶使用0. 01~lg，所配置的水溶液浓 度为0. 1%~10%。
[0027] -种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相在极性化合物的分离和修饰蛋白质 组学中的应用。
[0028] 与现有技术相比，本发明的积极效果是：
[0029] 本发明制备的色谱固定相具有很强的亲水作用及静电相互作用，是一种新型的酸 性糖涂覆型亲水色谱固定相。该固定相的设计与发展是基于前期工作基础上的再创新与技 术拓展。制备过程简单易控，反应条件温和，高选择性，高转化率。技术适用范围广，可换用 其他多种酸性糖介质的固载，对亲水色谱固定相的发展具有较大的促进作用。该固定相在 以乙腈/水作为流动相中对极性化合物或有着很好的保留和分离选择性，在色谱分离和修 饰蛋白质组学都有很广泛的应用价值。
[0030] 与现有技术相比，本发现的技术优点是：
[0031] 采用硅胶表面带电修饰工艺，很好地保留了硅胶基质本身机械稳定性好，比表面 大等优点；过程减少了有机溶剂的使用，简单且环保；合成工艺成熟且可控，稳定性强，重 复性好。 【【附图说明】】
[0032] 图1为使用实施例1所制备的固定相和纯硅胶在不同pH值的甲酸铵或乙酸铵溶 液中的Zeta-电势图；
[0033] 图2为使用实施例1所制备的固定相在亲水色谱模式下对核苷碱基混合样品的分 离色谱图：1为尿嘧啶，2为尿苷，3为胞嘧啶，4为胞苷，5为鸟苷；
[0034] 图3为使用实施例1所制备的固定相在亲水色谱模式下对糖类样品的分离色谱 图：A为核糖，B为甘露糖醇，C为山梨糖，D为麦芽糖醇，E为乳糖，F为海藻糖，G为松三糖， H为蔗果三糖，I为蔗果四糖；
[0035] 图4为使用实施例1所制备的固定相在亲水色谱模式下对果寡糖样品的分离色谱 图；
[0036] 图5为使用实施例1所制备的固定相富集糖蛋白酶解液所获得的质谱图：A为蛋 白酶解液未经富集的质谱图，B为蛋白酶解液经色谱固定相富集后的质谱图；
[0037] 图6为酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的化学结构式。 【【具体实施方式】】
[0038] 以下提供本发明一种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法与应用 的【具体实施方式】。
[0039] 实施例1
[0040] 在500ml三口烧瓶中加入350ml无水甲苯，20mL氯丙基三氯硅烷，置于IKTC油浴 中加热搅拌，进行氮气回流保护。然后加入粒径为5 μ m，孔径为MKJ ▲，比表面积为l〇〇m2g 1的球形活化硅胶颗粒20g，IKTC下反应24小时，反应结束用4#砂芯漏斗进行抽滤，依次用 甲苯、丙酮、水、甲醇清洗，抽干于80°C烘箱中干燥过夜。接着，将反应中间产物分散于20mL 乙腈溶液中，再加入N-甲基咪唑5g及四丁基碘化铵0. 9g，搅拌均匀，90°C下缓慢搅拌20 小时，然后用二氯甲烷、甲醇清洗，抽干于80°C烘箱中干燥过夜。将所得修饰的硅胶加到 1%的卡拉胶水溶液中，投料比为5 : 1