，室温搅拌12小时后先进行离心操作除去悬浮物， 然后用去离子水甲醇清洗，抽干于80°C烘箱中干燥过夜，得到最终材料。元素分析结果：C 8. 27%，N 1.49%，S I. 13%，H 1.75%。这里所用的卡拉胶为购买的试剂级产品，是从红藻 类的细胞壁中提取的粘多糖。阴离子型线状的多聚体，每个二糖类单元由带有一个（κ-)，2 个（I _)或3个（λ-)硫酸根的1，3α-1，4 β-半乳聚糖组成。元素分析结果：C 27.03%， N 0%，S 6·97%，Η 5. 11%。经计算的涂覆量为 162mg/g。
[0041] 取所得的卡拉胶涂覆型色谱固定相填料50mg分散到30mL水中制得待测试样品溶 液，取其中的ImL待测试样品溶液至离心管中，加入2mL IOOmM缓冲盐溶液（缓冲盐溶液为 各个PH值的甲酸铵或乙酸铵溶液），然后加去离子水至10mL。将其振荡均匀，超声至完全 混溶，最后转移到Malvem Zetasizer Nano_ZS90测试仪测定材料表面的电势变化，如图1 所示。结果显示，经过卡拉胶的涂覆，色谱固定相在pH 2到8之间一直保持电负性，说明硅 胶表面被卡拉胶较好地包覆。
[0042] 实施例2
[0043] 把实施例1所得的卡拉胶涂覆型色谱固定相填料填装于4. 6mm*150mm，I. D.的不 锈钢HPLC色谱柱中，制得的色谱柱用于测试其在亲水色谱模式下对强极性化合物的保留 和分离混合样品。流动相为三相，分别为乙腈，水，200mM的甲酸铵溶液（pH为3)。流动相 条件为90 %乙腈/IOmM的甲酸铵溶液（pH为3)，流速1.0 ml/min，柱温为30°C，检测波长为 256nm。色谱图如图2所示（1为尿嘧啶，2为尿苷，3为胞嘧啶，4为胞苷，5为鸟苷）。分离 结果显示，反相色谱柱死时间流出的极性化合物得到了很好的保留，表现出典型的亲水作 用模式。
[0044] 实施例3
[0045] 使用实施例2所制备的色谱柱分离在亲水作用色谱模式下分离糖和糖醇。流动相 为两相，分别为乙腈，水。流动相条件为乙腈和水的体积比为80/20,流速1.0 ml/min，柱温 为30°C，ELSD:吹扫氮气压力30psi，漂移管温度80°C。色谱图如图3所示（A为核糖，B为 甘露糖醇，C为山梨糖，D为麦芽糖醇，E为乳糖，F为海藻糖，G为松三糖，H为蔗果三糖，I 为蔗果四糖）。分离结果显示，糖和糖醇都得到了良好的分离与较好的峰型。
[0046] 实施例4
[0047] 使用实施例2所制备的色谱柱分离在亲水作用色谱模式下分离果寡糖样品。流动 相为三相，分别为乙腈，水，200mM的甲酸铵溶液（pH为3. 5)。流动相条件为0-30分钟由乙 腈 / 水 /200mM 的甲酸铵溶液（pH 为 3. 5) :80/15/5 (v/v/v) -60/35/5 (v/v/v)，流速 1.0 ml/ min，柱温为30°C，ELSD :吹扫氮气压力30psi，漂移管温度80°C。果寡糖样品的分离色谱图 如图4所示。分离结果显示，通过优化流动相条件，可实现寡糖样品的有效分离。
[0048] 实施例5
[0049] 使用实施例1所制备的色谱固定相富集人血清免疫球蛋白G，洗脱条件为乙腈/水 /甲酸：60/40/0. Uv/v/v)，如图5所示，（图中（A)为蛋白酶解液未经富集的质谱图，（B) 为蛋白酶解液经色谱固定相富集后的质谱图，糖肽信号以五角星表示）。从图中可知，经过 富集，糖肽的选择性和丰度有了很大的提高，表现出很好的富集选择性。
[0050] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相，其特征在于，其化学结构式为：其中SilicaGel为硅胶，经表面修饰后带正电荷，糖类化合物为酸性单糖、酸性寡糖或 酸性多糖，带负电荷。2. -种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，其具体步骤 为： (1) 硅胶预处理 硅胶加入质量浓度为1~40%的盐酸或硝酸溶液中，加热回流搅拌1~48小时，过滤， 水洗至中性，于100~160°C下干燥至恒重，得到活化硅胶； (2) 硅胶表面修饰 将步骤（1)所得的活化硅胶置于玻璃或者聚四氟乙烯反应容器中，在氮气氛围下加入 有机溶剂，搅拌均匀，滴加硅烷试剂，保持温度为20~200°C条件下搅拌2~48小时。待反 应体系冷却至室温，减压过滤并用甲苯、丙酮、甲醇水、甲醇洗涤，固体产品在60~KKTC条 件下干燥12~36小时，得到硅胶表面修饰的产品； (3) 硅胶表面带电修饰 将步骤（2)所得硅胶表面修饰的产品分散于乙腈溶液中，再加入N-甲基咪唑及相转移 催化剂，搅拌均匀，保持温度为20~200°C条件下搅拌2~48小时；反应结束后减压过滤 并用二氯甲烷、甲醇洗涤，固体产品在60~KKTC条件下干燥12~36小时，得到硅胶表面 带电修饰的产品； (4) 涂覆过程 将步骤（3)所得硅胶表面带电修饰的产品与酸性糖类化合物水溶液混合，搅拌均匀， 保持温度为10~80°C条件下搅拌1~60分钟；反应结束后减压过滤并用水、甲醇洗涤，固 体产品在60~100°C条件下干燥12~36小时，得到亲水色谱固定相。3. 如权利要求2所述的一种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特 征在于，在所述的步骤（2)中， 所述的有机溶剂为与水不互溶的有机溶剂，有机溶剂包括甲苯、乙苯、二甲苯、正己烷、 正庚烷、正戊烷、正辛烷、环己烷等苯系物和烷烃。4. 如权利要求2所述的一种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特 征在于，在所述的步骤（2)中， 所述的有机溶剂的使用量为每克活化硅胶使用2~IOOmL有机溶剂。5. 如权利要求2所述的一种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特 征在于，在所述的步骤（2)中， 硅烷试剂结构式为：其中，X为-0CH3, -OCH2CH3S-Cl，m= 1~12,A为-Cl;硅烷试剂的使用量为每克活 化硅胶使用0. 5~5mmol。6. 如权利要求2所述的一种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特 征在于，在所述的步骤（3)中， 所述的硅胶分散溶液的使用量为每克硅胶分散于2~IOOmL乙腈溶液，加入0. 1~Ig N-甲基咪唑及0. 01~0.Ig相转移催化剂。7. 如权利要求2所述的一种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特 征在于，在所述的步骤（3)中， 所述的相转移催化剂为常用的季铵盐相转移催化剂，包括苄基三乙基氯化铵（TEBA)、 四丁基碘化铵（TBAI)、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、四丁基硫酸氢铵（TBAB)、三辛基甲基 氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵等。8. 如权利要求2所述的一种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特 征在于，在所述的步骤（4)中， 所述的酸性糖类化合物为酸性单糖、酸性寡糖或酸性多糖等，包括葡萄糖醛酸、海藻酸 钠寡糖、卡拉胶寡糖、卡拉胶多糖等等，分子量范围在100~200万之间。9. 如权利要求2所述的一种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特 征在于，在所述的步骤（4)中， 所述的酸性糖类化合物的使用量为每克硅胶使用〇. 01~lg，所配置的水溶液质量浓 度为0. 1%~10%。10. -种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相在极性化合物的分离和修饰蛋白质组 学中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种酸性糖类化合物涂覆型亲水色谱固定相的制备方法与应用，其中Silica？Gel为硅胶，经表面修饰后带正电荷，糖类化合物为酸性单糖、酸性寡糖或酸性多糖，带负电荷。本发明提供了上述固定相材料的制备方法，利用电荷相互作用，将表面电荷化的硅胶与带相反电荷的酸性糖类化合物在水溶液体系中结合，以制备涂覆型亲水色谱固定相。该固定相得制备方法对比于传统的键合糖型固定相更为高效，方便，环保；同时考虑到酸性糖样品的结构特点，利用电荷相互作用有效实现硅胶表面的糖修饰。所设计的色谱固定相具有较好的分离选择性，重复性和稳定性。对于分离极性化合物有很大的应用潜在性。
【IPC分类】B01D15/30, B01J20/24, C07K1/20, B01J20/22
【公开号】CN105214616
【申请号】CN201510793687
【发明人】蓝闽波, 盛骞莹, 柯燕雄, 杨凯娅, 梁鑫淼
【申请人】华东理工大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月17日