本发明涉及测定各种食品血糖生成指数（GI）值的体外方法。本发明提供了便捷、廉价且准确的体外方法，该方法用于测定各种食物成分和制成食品的GI。
背景技术：
：随着社会结构的变化、生活节奏的加快、饮食习惯和食物构成改变及社会老龄化，人类疾病谱发生了很大转变，胰岛素抵抗相关慢性疾病，如糖尿病、心血管疾病、肥胖症、高血脂症、高血压等比例不断上升，已成为目前全球性重大的公共卫生问题。在这些疾病中，尤以糖尿病发病率增长显著，据估计，全世界糖尿病病人约有3.47亿，我国有1.14亿，潜在或隐性糖尿病患者更多。预防和控制上述疾病发生的关键在于科学合理的膳食结构。为此，1981年加拿大科学家Jenkins等提出了GI，用于描述人体对食物的消化吸收速率和由此引起的血糖应答。GI是评价碳水化合物（CHO）的一个生理学参数，在预防和治疗各种慢性疾病（如糖尿病、心脑血管疾病等）方面具有很大的应用价值和很强的可操作性。具有碳水化合物意识的消费者和健康护理人员能够使用GI或相关值选择适当的食物。GI最初的提出，主要用于糖尿病患者对富含淀粉食物的选择上，使膳食血糖指数维持在一定的合理范围内，以达到控制血糖的目的，提供糖尿病患者健康的饮食。而随着研究的不断深入，发现GI在预防和控制广泛的慢性病方面也具有很好的效果，为此，更多的科学工作者研究GI与慢性病之间的关系，并且利用GI的理论指导开发和生产适合慢性病患者食用的产品，GI已逐渐让更多人了解和接受。在澳大利亚、新西兰以及南非已有明确的低GI食品法律法规及检测标准，并允许生产企业使用低GI食品标签，在美国、英国、日本等国家，也相继出现了GI评价机构与低GI食品，并且发展势头强劲。而在我国，低GI研究也取得了较大成就，在最新的食物营养成分表中就有GI数据，便于消费者合理选择食物，但产业化相对落后，因此，消费者对此了解甚少。GI表示当食用含50g有价值的CHO的食物后，在一定时间内（一般为2h）体内血糖水平应答与食用相当量的葡萄糖或白面包引起的血糖应答水平的比值。餐后血糖应答一般用曲线下的面积（areaunderthecurve，AUC）表示，将50g葡萄糖或白面包在2h内的血糖应答曲线下面积（AUC）定义为100，其它食物的血糖指数则通过两者曲线下面积的比值乘以100计算。用公式表示为：GI=含有50gCHO的餐后血糖应答曲线下面积/50g葡萄糖（或白面包）的餐后血糖应答曲线下面积×100。GI代表了一种食物的生理学参数，与传统的物理化学方法不同，它能确切地反映食物摄入后人体的生理状态，是衡量食物引起人体餐后血糖反应的一项有效指标，更能真实地反映含有等量CHO的不同食物其消化吸收率和引起的血糖反应，从“质”的新理论区分CHO，是对以往单靠测量膳食能量和CHO摄入量的饮食控制一个极好的补充和提高。根据GI值，科学家将食物分为不同等级。高GI的食物进入人体后，消化快、吸收率高，能迅速进入血液引起血糖峰值高，胰岛素快速升高，导致血糖下降速度快，血糖变化剧烈；而低GI食物则消化慢，吸收率低，对血糖影响小，有利于控制血糖。人体试验是计算GI的最主要方法，也是目前国内外测定食品GI的标准方法，主要是依据GI的概念，通过测定人体食用含有50g（根据食物含CHO的量及人体一次摄入量可适当调整）有价值的CHO的食物后血糖变化情况，目前，已发布的食物GI表中的数据全部采用该方法测定的。人体试验测定GI方法受到多个因素的影响，包括受试对象身体健康状况、受试人数、测试前用餐、运动及药物要求、参考食物、被测食物中有效CHO、测试程序中的频次、葡萄糖监测方法及数据处理等。因此，为获得有价值的GI值，就需要对其测定方法进行标准化。人体试验虽然精确，但测定过程繁琐，所需要的时间和成本比较高，要求也比较严谨，对于政府机构或是高校及科研院所来讲，为了保证试验数据的准确性需要严格按照人体试验方法进行测定。但对于一些大型企业在开发产品的前期时，由于需要缩短研发周期及配方的快速调整，人体试验测定方法就存在不足，因此有必要开发一种便捷、廉价和准确的测试方法。为此，一些国外科研工作者探究模拟人体消化模式建立体外消化模型，通过体外方法测定产品的GI值。中国尚未有关体外消化模型测定食品GI的方法。由于体外消化模型方法在测定食物GI方面能够很好的复制及所需要的时间短和成本低等优势，在企业开发产品前期比较实用。有鉴于此，本发明人结合实际操作，并借鉴国外相关的研究发明了该体外消化模型方法用于测定食物GI。技术实现要素：本发明的主要目的是提供一种模拟人体体内消化的体外分析方法，用于测定各种食物的GI。本发明方法能够在一天内，由一名分析人员测定多种食物样品的GI，相对于传统人体体内方法，显著的降低了成本，提高了效率。使用本发明方法测定的GI值显示与使用人受试者的传统测试获得的结果有非常高的相关性。同时，本发明方法可用于宽范围的食品，包括固体食品、半固体食品和液体食品。本发明提供用于测定试验食品GI的体外方法，所述方法包括：1）测定试验食品的组成成分含量；2）称取合适量的测试样品，将测试样品在人体口腔模型中进行消化；3）将步骤2）中样品在人体胃模型中进行消化；4）将步骤3）中样品在人体肠道模型中消化；5）将步骤4）中经过所述固定时间消化后，立即将模拟消化的样品取样处理，已停止酶反应；6）测定来自步骤5）的消化样品中不同消化时间的葡萄糖含量；7）使用预测方程，从步骤6）中得到的试验数据，计算该试验食品的GI，所述预测方程源自校准样品的校准数据分析，其中所述校准数据为相同类型，且以与步骤（1）至（6）中测定的试验食品的数据相同的方式获得，且其中所述校准样品具有已知的体内GI值。本发明体外方法可用于测定固体、半固体和液体食品的GI值，同目前可得到的体外方法相比，具有更接近人体体内消化环境，所采用的生物酶基本与人体酶特性类似，更有来自人体克隆的生物酶，显著提高了结果的准确度。由本发明方法获得的数据准确度与商业上可得到的体内方法相当，同时显著节约时间和成本。为了本发明的目的，“合适量的测试样品”表示通过测试样品中所含有的碳水化合物的量计算得到，使所测试样品中含有的有效碳水化合物的量为1g的测试样品量，即为“合适量的测试样品”。所采用的参照品为麦芽糖，其特征在于，麦芽糖的GI值为已知，同时食品中的有效碳水化合物多数为淀粉类物质，通过消化途径降解过程中有麦芽糖产生，而麦芽糖能被淀粉葡萄糖苷酶完全降解生成葡萄糖（即水解率为100），进入血液，引起血糖升高。为了本发明的目的，口腔、胃和肠道模型的建立都是在250mL碘量瓶中进行的，通过水浴摇床模拟口腔、胃和肠道的温度，采用先粉碎机打碎，再筛网过筛，最后研钵敲打方法模拟口腔咀嚼过程，利用加入玻璃球和摇床模拟胃、肠蠕动，通过缓冲溶液以及盐酸和氢氧化钠调节口腔、胃和肠道所需要的pH环境，通过各种盐离子模拟消化环境所需要的离子浓度，通过瓜儿豆胶模拟胃黏液，通过猪胆盐模拟小肠消化中的胆盐。为了本发明的目的，模拟唾液用克隆来源于人类唾液的α-淀粉酶（Sigma，CAS号9000-90-2）配制，具体配置过程为：0.025g酶粉加入100mL蒸馏水，在35oC，150rpm中保持20min，然后1500rpm，离心15min，上清液即为模拟唾液。此模拟唾液需要现用现配。为了本发明的目的，模拟胃液用克隆来源于猪胃粘膜胃蛋白酶（Sigma，CAS号9001-75-6）配制，加入盐离子和瓜尔豆胶形成相应离子浓度和黏度，具体配置为：0.5g胃蛋白酶粉和0.024gNaCl溶解于60mLpH6.9的磷酸缓冲液（0.1mol/L），待全部溶解后，缓慢加入0.5g瓜尔豆胶，边加入边搅拌，直至溶解，所形成的溶液即为模拟胃液。此模拟胃液需要现用现配。为了本发明的目的：模拟胰液主要由来源于猪胰腺的胰酶（Sigma，CAS号8049-47-6）、来源于黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶（Sigma，CAS号9032-08-0）和来源于面包酵母的蔗糖酶（Sigma，CAS号9001-57-4）配制，具体包括125μL的A部分，125μL的B部分，200μL的C部分和200μL的D部分组成。其中A、B、C和D四部分是由以下组成：1）A部分是含有0.06mol/LMgCl2和0.3mol/LCaCl2的MgCl2-CaCl2溶液。2）B部分是由来源于猪胰腺的胰酶（Sigma，CAS号8049-47-6）配制，其通过以下步骤配制而成：4g胰酶粉和4g猪胆盐加入100mL蒸馏水，在35oC，150rpm中保持20min，然后在1500rpm，离心15min，取上清液即为B部分。3）C部分是来源于黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶（Sigma，CAS号9032-08-0）。4）D部分是由来源于面包酵母的蔗糖酶（Sigma，CAS号9001-57-4）配制，其通过以下步骤而成：0.01g酶粉加入到10mLpH6.9，0.1mol/L的磷酸缓冲液中，搅拌均匀后，10000rmp，冷冻离心10min，吸取上清液即为D部分。以上酶液需要现用现配。为了本发明的目的：所选取的固定消化时间点建议选取8-12个，鉴于结果更加精确以及同时测定平行样品较少时，可以选取更多点。在所选取的时间点中一定要包含120min时间点，并且多取一些在消化模拟前期的时间点。为了本发明的目的：采用有机溶剂和加热共同作用终止模拟消化中生物酶的催化作用。具体为在设定的固定消化时间点取样1mL，迅速加入到含有4mL无水乙醇的试管中，于60oC加热10min，然后立即冰水浴中冷却。为了本发明的目的：以上样品经如下步骤操作后采用高效液相方法测定葡萄糖浓度，具体为：样品在冷冻离心机中离心，10000rmp，10min，吸取上清液，用双蒸水稀释合适比例后，利用0.45μm水相微孔过滤膜除杂，装入液相检测样品瓶中，封盖即可。所采用的高效液相方法条件包括以下内容：采用Hypersil-NH2柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-水（70：30，v/v）混合液，流动相使用前以微孔有机滤膜（0.45μm）过滤，超声脱气；流速为1.0mL/min；柱温温度为30oC；监测器为示差检测器；进样量为10μL。为计算样品葡萄糖浓度，需要建立葡萄糖浓度标准曲线，以不同浓度的葡萄糖标准溶液与峰面积作图制作标准曲线，样品中葡萄糖浓度依据所绘制的标准曲线进行计算。为了本发明的目点，采用预测方程为GI=0.862HI+8.189（HI为2h内水解率）计算食品GI，而HI的获得，是通过以下步骤计算得到：1）依据上述获得不同消化时间葡萄糖含量，绘制葡萄糖浓度变化图（折线图）；2）利用分段梯形计算方法求得2h内曲线下的面积A；3）以参照品的HI为100，根据1）中参照品和样品模拟消化过程中葡萄糖浓度变化图下的面积比，计算样品的HI，即HI样品=A参照品/A样品×100。获得样品HI后，依据预测方程得到样品的GI。附图说明图1提供描述用于评估GI及相关值的体外模型消化方法的流程图。具体实施方式以下实施例将举例说明本发明，但并不限制本发明。除非另外指出，所有的百分比和比例基于重量计。本文中引用的所有出版物通过引用结合到本文中。下述实施例中所述方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1：为了进行本发明体外GI的测定，为了对方法的校准和未知样品的测定，该实施例提供详细的分析方案。在建议了具体设备、试剂和/或具体方法和操作参数的所有情况下，将会理解可使用等同的设备、试剂和/或具体方法和操作参数。仪器：1、电热恒温干燥箱；2、分析天平（精密至±0.0001g）；3、扁形铝制或玻璃制称量瓶；4、干燥器；5、马福炉；6、石英坩埚；7、电炉；8、自动凯氏定氮仪；9、索式提取器；10、高效液相仪；11、温控的振荡水浴摇床；12、实验室用小型粉碎机；13、旋涡混合器；14、碘量瓶（250mL）；15、移液器（200μL、1000μL、5000μL和多道移液器）；16、玻璃球（6mm）；17、带螺旋盖的玻璃样品瓶（2mL）；18、筛网（60目）；19、10mL注射器；20、0.45μm过滤器（水相和有机相）；21、实验室用超声仪；22、研钵棒；23、pH计；24、计时器；25、恒温水浴锅；26、高型无导流口烧杯；27、真空抽滤装置；28、真空干燥箱；29、打浆机；30、量筒；31、玻璃棒；32、冷冻离心机；33、药勺；34、洗瓶；35、恒温水浴锅。试剂：1、盐酸；2、氢氧化钠；3、硫酸铜；4、硫酸钾；5、硫酸；6、硼酸；7、甲基红指示剂；8、溴甲酚绿指示剂；9、亚甲基蓝指示剂；10、无水石油醚；11、无水乙醇；12、磷酸二氢钠；13、磷酸氢二钠；14、来源于人类唾液的α-淀粉酶（Sigma，CAS号9000-90-2）；15、来源于猪胃粘膜胃蛋白酶（Sigma，CAS号9001-75-6）；16、氯化钠；17、瓜尔豆胶；18、氯化镁；19、氯化钙；20、来源于猪胰腺的胰酶（Sigma，CAS号8049-47-6）；21、来源于黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶（Sigma，CAS号9032-08-0）；22、来源于面包酵母的蔗糖酶（Sigma，CAS号9001-57-4）；23、猪胆盐；24、色谱级乙腈；25、色谱级甲醇；26、无水葡萄糖；27、双蒸水；28、丙酮；29、重铬酸钾；30、三羟甲基氨基甲烷；31、2-（N-吗啉代）乙烷磺酸；32、冰乙酸；33、硅藻土；34、来源于地衣芽孢杆菌的蛋白酶液（Sigma，CAS号9014-01-1；35、麦芽糖。样品组成成分含量分析：水分含量测定采用GB5009.3-2010中的烘干法。粗蛋白质采用GB5009.5-2010中的凯氏定氮法。灰分的测定采用GB5009.4-2010灼烧法。脂肪的测定采用GB5009.6-2003中的索氏抽提法。膳食纤维的测定采用GB5009.88-2014中的酶重量法。总碳水化合物的测定采用差减法。固体样品的制备：1、样品放置在实验室用粉碎机中粉碎直至样品完全混合（通常30-60s）。2、将粉碎后的样品加入到60目筛网中，手动摇晃，选取筛网下边的样品即为固体样品。半固体样品的制备：样品搅匀后，整体倒入实验室用打浆机中打碎直至样品成浆并且完全混合（通常30-60s）。液体样品的制备：因为液体样品基本上均匀且组分可溶解于载体中，液体食品无需要任何粉碎。消化方法：1、称取相当于1g有效碳水化合物的样品量（样品有效碳水化合物含量=100-水分-蛋白-灰分-脂肪-膳食纤维）至250mL碘量瓶中，加入1mL在37oC预热的模拟唾液和3mL浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲溶液，混匀后在37oC的环境中用研钵棒轻轻上下敲打15次（或15s）。立即用4mLpH6.9的磷酸缓冲液（0.1mol/L）冲洗研钵棒，保证研钵棒上的样品都转移至碘量瓶中，加入6mL模拟胃液，利用2mol/LHCl溶液调到pH1.5，放入3-5颗玻璃球，然后放在37oC摇床中保温30min，水浴摇床转速为120rpm。将10mL磷酸缓冲液（pH6.9，0.1mol/L）加入到上述溶液中，利用50%的NaOH溶液调节pH为6.9；然后加入650μL模拟胰液，补充蒸馏水至50mL，在37oC摇床中保温180min，摇床转速为120rpm。样品取样方法：在固定消化时间点，立即从上述消化体系中中均匀吸取1mL消化液加入到含有4mL无水乙醇的试管中，于60oC加热10min，然后立即在冰水浴中冷却。不同消化时间点样品中葡萄糖含量的测定：样品中葡萄糖含量的测定按如下所述由HPLC方法分析其含量：1、设备-Agilent色谱系统，由如下组件组成：高效泵；液相色谱模块；示差检测器；洗脱液脱气模块和AgilentChromeleon色谱工作站。2、试剂和标准品：70%乙腈溶液（v/v）和葡萄糖标准溶液。3、条件：采用Hypersil-NH2柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-水（70：30，v/v）混合液；流速为1.0mL/min；柱温温度为30oC；监测器为示差检测器；进样量为10μL。4、溶液的制备：洗脱液：用300mL双蒸水稀释700mL乙腈，以微孔有机滤膜（0.45μm）过滤，超声脱气。5、标准溶液的制备：精确（精确至0.0001g）称取干燥好的无水葡萄糖1.0000g至100mL量瓶中，以制得10g/L标准品溶液。稀释该溶液以制得如下工作标准溶液：a）1mL稀释至10mL以制得1g/mL标准溶液；b）2mL稀释至10mL以制得2g/mL标准溶液；c）4mL稀释至10mL以制得4g/mL标准溶液；d）6mL稀释至10mL以制得6g/mL标准溶液；e）8mL稀释至10mL以制得8g/mL标准溶液及f）10g/L。6、样品的制备和注入：来自消化方法的最终消化溶液按合适比例用双蒸水稀释，然后经0.45μm水相微孔过滤膜除杂，装入液相检测样品瓶中，封盖即可，利用自动进样器（10μL）注入至色谱仪中。7、葡萄糖的定量测定：不同浓度的标准品分别注入至HPLC中，使用色谱系统用的合适软件作校准曲线。如果样品中葡萄糖的浓度超过最高标准品的浓度，则应对样品进行适当稀释，使所测稀释后样品中葡萄糖浓度包含在标准样品浓度梯度中。样品注入至HPLC中，使用峰面积从校准曲线计算葡萄糖的浓度。来自校准曲线的浓度乘以稀释倍数，即为不同消化时间点样品中葡萄糖浓度。计算：通过预测方程GI=0.862HI+8.189完成对样品GI预测值的测定。通过上面的HPLC方法分析消化后不同时间点中样品的葡萄糖含量，绘制葡萄糖浓度变化图（折线图），采用分段梯形面积计算方法计算消化2h内折线图下的面积。定义麦芽糖的水解率HI为100，根据样品与麦芽糖消化过程中葡萄糖浓度变化图下面积之比，计算样品的HI，从而依据预测方程获得样品的GI。实施例2：使用体内和体外实验方案检查大量商业上可得到的食品和其他食物样品。使用体内试验测定的体内GI值取自科学文献。体外试验测定的体外GI值按照实施例1中描述的本发明体外方法进行。然后使用预测方程计算体外GI值。使用从以下商业上可得到的产品测定所得的体外GI值与体内GI比较见表1：表1体外方法测定的GI值与体内方法测定的GI值比较样品体内GI*体外GI麦芽糖10594蔗糖5863法国面包7279燕麦面包6560白面包7177大麦片6965玉米片7471燕麦粥5553玉米粥6870甜玉米5553小米粥6265大米粥6970燕麦饼干5550年糕8290苹果3931香蕉6264柑桔4043菠萝6668西瓜7276鹰嘴豆3634云豆2923扁豆2926大豆1519腰果2521花生711荞麦面5964油炸土豆条5147蜂蜜4644南瓜5146胡萝卜3531土豆6962芋头4843甘薯5450藕粉3328牛奶1116*体内值取自：“血糖生成指数的国际表和血糖负荷值，”DiabCare，2008，31（12），1-58。由表可以看出，该体外模拟消化方法明显具有非常高的精确度和高的预测价值，尤其在于通过GI>70为高GI食物，55<GI≤70为中GI食物，GI≤55的食物为低GI食物的划分分类上，存在非常好的一致性。并且，该方法适用于固体、半固体和液体食品中GI的测定。因此，该方法可以作为企业和科研院所前期开发新产品GI值的预测。通过简单进行文中描述用于样品制备和分析的方法，并使用所需预测方程，随后可使用该体外方法计算未知食品或食物成分的体外GI值。只要使用相同方法用于所有样品，分析过程中不会出现显著影响本发明方法预测能力的差异。我们相信，这证明该体外方法的稳定性。该体外方法可用于准确并精密测定各种食品和/或食物成分的GI值。可使用该方法容易、快速且便宜的获得具有准确预测价值的GI值，与目前推荐的更耗时且更昂贵的人受试者体内试验相比，在准确度方面有利。上述实施例并非限定本发明所限定的保护范围，任何所属
技术领域：
的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。当前第1页1 2 3