本发明涉及甘蔗内源激素检测
技术领域：
，特别是一种甘蔗叶片中苹果酸含量的HPLC检测方法。
背景技术：
：甘蔗（Saccharumofficinarum)是我国最重要糖料作物，蔗糖占我国食糖总产92%。甘蔗中含有的植物激素几乎参与了其生长发育所有过程的生理调节，从细胞的生长分裂和分化，到种子的休眠、果实发育、性别分化和衰老过程等。对于甘蔗而言，它有2个非常重要的指标直接影响着甘蔗的经济价值，分别糖分和产量，但如果甘蔗受到病虫害影响而不能及时发现，则会大大影响甘蔗的糖分和产量。如果能够通过研究甘蔗生长过程中内源激素的变化趋势，判断甘蔗品种感染病原后的感抗差异，并建立对应病原菌胁迫应答的生化机制，那么将对甘蔗经济价值的增长具有重大的现实意义。甘蔗梢腐病最早是在印尼首先发现的，并随甘蔗品种POJ2878及其衍生品种的推广蔓延至全世界，其发病最高级和严重阶段，会导致蔗株心叶整个基部腐烂和快速失水，最终在甘蔗梢部幼嫩组织上形成顶腐状，从而造成产量和糖分损失。尤其近年，云南、广西蔗区种植的桂糖11号、GT21号和主推的桂糖37号多为感病品种，ROC22以及ROC16等主栽品种感染梢腐病程度也日益严重，这给糖业安全生产带来了严重影响。甘蔗在受到梢腐病病原侵染时，会产生一系列的防御反应来保护自己。在与病原菌的互作过程中，蔗株内源激素的含量和活性发生变化，由此影响甘蔗正常生理生化进程，从而感染甘蔗并导致发病。因此，对感染梢腐病病原后的内源激素变化趋势研究是十分紧迫的问题。苹果酸是生物体代谢过程中产生的重要有机酸，在线粒体产生能量物质ATP的代谢过程中起到重要作用，不仅能够促进提高植物根系活力，增加各器官中有机酸和还原糖的含量，且与其他激素物质的合成密切相关。但至今尚无建立高效、精确的甘蔗叶片苹果酸含量检测方法，鉴于此建立一套快速有效的甘蔗叶片苹果酸含量检测方法，对及时判断甘蔗品种感染病原后的感抗差异和研究苹果酸内源激素介导甘蔗梢腐病病原菌胁迫应答的生化机制具有非常重要的意义。技术实现要素：针对我国甘蔗叶片苹果酸含量检测方法的空白，本发明的目的在于提供一种简便、快速、准确的甘蔗叶片中苹果酸含量的HPLC检测方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方法如下：一种甘蔗叶片中苹果酸含量的HPLC检测方法，其特征在于包括以下步骤：S1.将待测的甘蔗叶片加入预冷至2~5℃的体积分数为70~90%甲醇水溶液，再加入液氮研磨成浆，定容，2~5℃浸提50~90min，超声提取1.5~3h，离心，取上清液，残渣再加入预冷至2~5℃的体积分数为70~90%甲醇水溶液超声提取20~40min，离心后取出上清液，重复残渣浸提和离心操作0~3次，合并上清液，用70~90%甲醇定容，过滤，作为样品溶液备用；S2.采用HPLC检测样品溶液中苹果酸的含量。进一步的，所述步骤S2中，HPLC色谱条件为：流动相由12.5mmol/L的磷酸二氢钠水溶液与甲醇按体积比50:1混合，再加入0.5mol/L的磷酸水溶液调节pH至2.8；柱温为32~38℃，流速0.8~1.2mL/min，紫外检测波长214nm。更进一步的，所述步骤S6中，HPLC色谱条件为：柱温为35℃，流速0.8mL/min，进样量10μL。进一步的，所述步骤S1中，所述待测的甘蔗叶片预先从甘蔗上置于冰盒上剪下。进一步的，所述步骤S1中，待测的甘蔗叶片和残渣浸提采用的是体积分数为80%的甲醇水溶液。进一步的，所述步骤S1中，待测的甘蔗叶片和残渣浸提的温度为4℃。进一步的，所述步骤S1中，甘蔗叶片研磨成浆后，加入超净水进行定容。进一步的，所述步骤S5中，过滤采用针头式过滤器进行。本发明还提供了以上所述的检测方法在判断甘蔗品种对梢腐病感性和抗性差异方面的应用。本发明的有益效果是：1）样品前处理方法采用浸泡和超声提取相结合的方法提取苹果酸，与其他方法相比，提取快速，提取有效成分完全，除杂效果好，待测样品纯净度高。2）通过本发明HPLC色谱条件测量样品溶液中苹果酸的含量，苹果酸能与其他有效成分较好地进行分离，且检测速度快，重复性和准确性好，在具备高效液相色谱仪的实验室均能通过此法开展苹果酸含量检测工作。3）本发明尤其适用于感染梢腐病的甘蔗叶片中苹果酸含量的测定，通过上述样品的前处理方法和色谱条件，能排除梢腐病病原菌对检测结果的干扰，从而为判断甘蔗品种对梢腐病感抗差异研究和苹果酸介导甘蔗梢腐病病原菌胁迫应答生化机制提供科学有力的检测技术；同时，本发明方法的推广使用，对于筛选抗病品种和指导甘蔗抗病育种也具有重要意义和现实作用。附图说明图1为苹果酸的标准曲线。图2a为标准溶液检测得到的色谱图。图2b为样品溶液检测得到的色谱图。图3为不同生长阶段甘蔗样品中苹果酸的含量的趋势分析图。具体实施方式下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。实施例1甘蔗叶片中苹果酸含量的HPLC检测方法S1.选取感染甘蔗梢腐病病原的甘蔗叶片作为待测样品，取待测样品2g，加入4mL预冷至4℃的体积分数为80%甲醇，加入液氮研磨成浆，用超净水定容至10ml，4℃浸提1h，超声提取2h，10000r/min离心10min，取上清液，残渣再加入2mL预冷至4℃的体积分数为80%甲醇超声提取30min，10000r/min离心10min，离心后取出上清液，合并上清液，用体积分数为80%甲醇定容至8mL，取适量定容后的溶液用针头式过滤器过滤于带有内衬管的样品瓶内，作为样品溶液备用；S2.采用HPLC检测样品溶液中苹果酸的含量。S2-1.色谱条件：ARigolL3000高效液相色谱仪；色谱柱：CSTC18反相色谱柱（250mm*4.6mm,5μm）；流动相：12.5mmol/L的磷酸二氢钠水溶液800mL，加入16mL甲醇，用0.5mol/L的磷酸水溶液调节溶液pH至2.8，混匀；柱温：35℃；流速：0.8mL/min；检测波长：214nm；进样体积：10μL。S2-2.称取苹果酸标准品2.5mg，加入10mL水溶解，配置成250μg/mL的标准溶液母液；然后用标准溶液母液再一次稀释成浓度分别为50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的标准溶液，采用S2-1的色谱条件检测标准溶液母液和标准溶液，其对应峰面积分别为342.078、68.7、31.08、12.808、5.983、1.367；然后以峰面积为纵坐标、以苹果酸浓度为横坐标做标准曲线，标准曲线如图1所述，由图1可见，在所检测范围内(1μg/mL～250μg/mL)，回归方程式为y=1.3723x-0.9876，液相色谱峰面积与苹果酸浓度具有良好的线性关系(R2=0.9976)。S2-3.专属性考察：分别取10μL的250μg/mL标准溶液母液和样品溶液注入液相色谱仪中，采用S2-1的色谱条件检测，标准溶液母液中苹果酸的保留时间为5.273min，样品溶液中苹果酸的保留时间为5.267minn，结果分别见图2a和图2b。S2-4.加标回收实验：分别向同一样品溶液中添加1mL的10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、50μg/mL的标准溶液，采用S2-1的色谱条件检测，计算回收率。表1苹果酸回收率测定结果S2-5.方法精密度试验取浓度为5μg/mL的标准溶液，采用S2-1的色谱条件检测，连续进样5针观察保留时间与峰面积，检测结果见表2。表2方法精密度实验结果编号保留时间（min）峰面积（μvsec）15.2734.76525.2424.32435.2854.82045.2234.72755.2524.638标准偏差0.0250.196相对标准偏差0.4694.220S2-6.S1获得的样品溶液分析采用S2-1的色谱条件检测，重复测定三次，得样品的中苹果酸的含量为34.221μg/g。由本实施例可以看出，本方法的灵敏度、检出限和精密度能够满足甘蔗叶片中苹果酸含量的测定；尤其适用于感染梢腐病的甘蔗叶片中苹果酸含量的测定，通过上述样品的前处理方法和色谱条件，能排除梢腐病病原菌对检测结果的干扰。实施例2判断甘蔗品种感染梢腐病后的感性和抗性差异研究（1）接种体的制备：将甘蔗梢腐病病原菌接种于PDA培养基上活化3天，挑取PDA培养基边缘菌丝接种在灭菌的马铃薯葡萄糖水培养基中振荡培养3天，离心、用灭菌的脱脂棉过滤、收集所获得的菌体，用无菌水与菌体配制成浓度为1×106CFU/ml甘蔗梢腐病病原菌孢子悬浮液。（2）接种材料的处理：选取甘蔗品种YT94-128、甘蔗品种GT37为接种材料，温室条件下每个品种种植30桶，每桶4个芽，下种前用0.3%多菌灵浸种20min，出苗后正常管理，长出5～6片完全叶时进行接种。（3）注射接种：取长势相同的甘蔗品种YT94-128、甘蔗品种GT37的幼苗各30株，使用1ml医用注射器分别将100μl甘蔗梢腐病病原菌孢子悬浮液到甘蔗+1叶位，作为甘蔗接种样品；再另外取长势相同的甘蔗品种YT94-128、甘蔗品种GT37的幼苗各30株，以注射无菌水为对照，作为甘蔗对照样品；甘蔗接种结束后保持室内温度28-30℃，湿度80%。（4）样品选取:选择相同株龄+1叶位上相同位置有近似病症的甘蔗叶片，在冰盒上将其剪成1cm×1cm的叶片进行备样。（5）检测方法与结果S1.取各生长阶段（0、4、8、16d）的甘蔗接种样品和甘蔗对照样品叶片2g，分别加入4mL预冷至4℃的体积分数为80%甲醇水溶液，加入液氮研磨成浆，用超净水定容至10ml，4℃浸提1h，超声提取2h，10000r/min离心10min，取上清液，残渣再加入2mL预冷至4℃的体积分数为80%甲醇水溶液超声提取30min，10000r/min离心10min，离心后取出上清液，合并上清液，用80%甲醇水溶液定容至8mL，取适量定容后的溶液用针头式过滤器过滤于带有内衬管的样品瓶内，作为样品溶液备用；S2.采用HPLC检测样品溶液中苹果酸的含量。S2-1色谱条件：ARigolL3000高效液相色谱仪；色谱柱：CSTC18反相色谱柱（250mm*4.6mm,5μm）；流动相：12.5mmol/L的磷酸二氢钠水溶液800mL，加入16mL甲醇，用0.5mol/L的磷酸水溶液调节溶液pH至2.8，混匀；柱温：35℃；流速：0.8mL/min；检测波长：214nm；进样体积：10μL。S2-2取不同生长阶段（2、4、8、16d）的甘蔗接种样品YT94-128、GT37和甘蔗对照样品制成的研究样品溶液，进行苹果酸含量的测定，每个样品重复测定3次，使用实施例1S2-2制得的标准曲线计算结果，结果见表3。表3不同生长阶段甘蔗接种样品中苹果酸的含量S2-3实验结果分析苹果酸（MA）参与植物体内多种代谢和抗逆反应，包括三羧酸循环、C4循环、乙醛酸循环等，其主要作用是传递C02、转移NADPH、调节细胞pH值和氧化还原电位。经鉴定，YT94-128对梢腐病表现出抗性，GT37对梢腐病表现出感性。由上述表3获得的数据制得苹果酸含量的趋势分析图，如图3所示，其中，A为接种样品YT94-128的苹果酸含量变化趋势，B为对照样品YT94-128的苹果酸含量变化趋势，C为对照样品GT37的苹果酸含量变化趋势，D为接种样品GT37的苹果酸含量变化趋势，结合图3所示，对照样品中的苹果酸含量随甘蔗生长而逐渐上升，抗病品种YT94-128的苹果酸含量变化趋势高于感病品种GT37；病原菌接种处理的YT94-128叶片苹果酸含量随甘蔗生长而不断上升并趋于稳定，GT37在接种处理4天时出现波峰然后随之下降并趋于稳定；其中，对照之间苹果酸含量差异并不显著，而接种4天后处理间含量差异达到极显著。本试验说明，空白处理下，抗病品种YT94-128叶片合成苹果酸的速率要高于感病品种GT37；在接种病原菌后，感病品种GT37梢腐病病情指数不断加重，其叶片合成苹果酸的能力逐渐受到影响，同时蔗株在受到生物（病原菌）和非生物（针刺）胁迫后发生苹果酸次生合成反应，但前者大于后者，从而导致GT37叶片中苹果酸含量出现波峰后呈缓慢降低趋势。抗病品种YT94-128在接种病原菌后，因其病情指数并不严重，其在接种后叶片苹果酸含量不断增加，在接种10天左右达到一个稳定状态，这也反映苹果酸含量与甘蔗梢腐病病情指数呈负相关，与抗性呈正相关。结论：由试验可看出，参试材料在病原菌与甘蔗“侵染与反侵染”以及植株生长双重作用影响下逐渐表现出不同的分泌特征，这一试验结果为研究苹果酸抗逆性生理生化机制、筛选抗病品种和指导甘蔗抗病育种提供了重要的技术参考。本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属
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的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。当前第1页1 2 3