本发明涉及一种检测方法，具体是一种牛奶中腹泻性贝类毒素含量检测方法。
背景技术：
当前，我国用于腹泻性贝类毒素(diarrheticshellfishpoisoning，DSP)的检测方法主要有小鼠生物法及酶联免疫吸附检测法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)。小鼠生物法的检测原理：贝类样品用丙酮、乙醚提取后，经减压蒸干，以1％吐温-60生理盐水溶解后注射入小鼠腹腔，观察小鼠存活情况，计算其毒力。ELISA的检测原理：测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对大田软海绵酸(okadaicacid，OA)(DSP的主要成分)抗体的捕捉抗体，加入标准或样品溶液及OA酶标记物，游离OA与OA酶标记物竞争OA抗体，同时OA抗体与捕捉抗体连接。洗涤后，将底物和发色剂加入到孔中并且孵育。加入终止液后，在450nm波长下测定吸光度值。小鼠生物法是当前我国腹泻性贝类毒素的标准检测方法，但其不足之处显而易见，如：(1)动物使用带来的伦理问题，受到动物保护组织的强烈反对；(2)灵敏度低，可比性和重复性差，检测结果与小鼠的品系、体重及状态等有关，难以形成统一的检测标准；(3)准确性差，该方法只能检测出毒力的大小，无法确定毒素的成分和含量，容易因高浓度的锌或不饱和脂肪酸的存在导致假阳性；(4)样品提取过程复杂。ELISA法主要存在以下不足：抗体往往只针对主要成分，其类似物可能会产生交叉反应，从而出现假阳性或对毒性的估计不准确；(2)单克隆抗体的制备困难，试剂盒价格昂贵。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种牛奶中腹泻性贝类毒素含量检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种牛奶中腹泻性贝类毒素含量检测方法，包括步骤：A)培养人HL-7702肝细胞，选用不同浓度的大田软海绵酸(okadaicacid，OA)染毒细胞，检测OA作用细胞后F-肌动蛋白(F-actin)解聚效应大小，从而建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线；B)根据HL-7702肝细胞的F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，建立腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测方法，确定可能的检出限范围；C)选择与腹泻性贝类毒素可能共存的成分：石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、软骨藻酸(domoicacid，DA)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin，YTX)中的一种或几种，分别以不同浓度作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性；D）将活化好的生物素溶解于DMSO中，使其浓度为2.5mg/mL，分装后，置于-20℃保存；每2mL浓度为5mg/mL的毒素单克隆抗体，在0.1MpH8.5的碳酸盐缓冲液中，透析过夜，第二天取出，备用；取透析好的毒素单克隆抗体1.6mL，约8mg，加1MpH8.5碳酸盐缓冲液300uL，混匀后，再加生物素500uL，室温搅拌2h；加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，4℃搅拌0.5小时；离心，弃上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，5-10℃搅拌1~2小时；弃上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，终体积为4mL，PAGE及ELISA检测产物效价。
作为本发明进一步的方案：还包括如下步骤：同步使用小鼠生物法、ELISA法及细胞F-actin检测法对采集的贝类样品分别进行腹泻性贝类毒素检测，并进行结果比对。
作为本发明进一步的方案：采用双抗体夹心法原理定量检测样品中生物毒素；用制备的试纸条检测样品中的生物毒素，每一种毒素检测试纸条上均有对照线C和检测线T，不同毒素检测判断的原则相同。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤C)选用不同浓度石房蛤毒素、虾夷扇贝毒素中的一种或几种浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明牛奶中腹泻性贝类毒素含量检测方法能有效检测牛奶中的腹泻性贝类毒素含量，相比于背景技术中提及的方法，具有操作简单，成本低的优点。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种牛奶中腹泻性贝类毒素含量检测方法，包括步骤：A)培养人HL-7702肝细胞，选用不同浓度的大田软海绵酸(okadaicacid，OA)染毒细胞，检测OA作用细胞后F-肌动蛋白(F-actin)解聚效应大小，从而建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线；B)根据HL-7702肝细胞的F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，建立腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测方法，确定可能的检出限范围；C)选择与腹泻性贝类毒素可能共存的成分：石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、软骨藻酸(domoicacid，DA)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin，YTX)中的一种或几种，分别以不同浓度作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性；D）将活化好的生物素溶解于DMSO中，使其浓度为2.5mg/mL，分装后，置于-20℃保存；每2mL浓度为5mg/mL的毒素单克隆抗体，在0.1MpH8.5的碳酸盐缓冲液中，透析过夜，第二天取出，备用；取透析好的毒素单克隆抗体1.6mL，约8mg，加1MpH8.5碳酸盐缓冲液300uL，混匀后，再加生物素500uL，室温搅拌2h；加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，4℃搅拌0.5小时；离心，弃上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，5-10℃搅拌1~2小时；弃上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，终体积为4mL，PAGE及ELISA检测产物效价。还包括如下步骤：同步使用小鼠生物法、ELISA法及细胞F-actin检测法对采集的贝类样品分别进行腹泻性贝类毒素检测，并进行结果比对。采用双抗体夹心法原理定量检测样品中生物毒素；用制备的试纸条检测样品中的生物毒素，每一种毒素检测试纸条上均有对照线C和检测线T，不同毒素检测判断的原则相同。所述步骤C)选用不同浓度石房蛤毒素、虾夷扇贝毒素中的一种或几种浓度。
实施例1：
本发明牛奶中腹泻性贝类毒素含量检测方法，包括步骤：A)培养人HL-7702肝细胞，选用不同浓度的大田软海绵酸(okadaicacid，OA)染毒细胞，检测OA作用细胞后F-肌动蛋白(F-actin)解聚效应大小，从而建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线；B)根据HL-7702肝细胞的F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，建立腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测方法，确定可能的检出限范围；C)选择与腹泻性贝类毒素可能共存的成分：石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、软骨藻酸(domoicacid，DA)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin，YTX)中的一种或几种，分别以不同浓度作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性；D）将活化好的生物素溶解于DMSO中，使其浓度为2.5mg/mL，分装后，置于-20℃保存；每2mL浓度为5mg/mL的毒素单克隆抗体，在0.1MpH8.5的碳酸盐缓冲液中，透析过夜，第二天取出，备用；取透析好的毒素单克隆抗体1.6mL，约8mg，加1MpH8.5碳酸盐缓冲液300uL，混匀后，再加生物素500uL，室温搅拌2h；加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，4℃搅拌0.5小时；离心，弃上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，5℃搅拌1小时；弃上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，终体积为4mL，PAGE及ELISA检测产物效价。还包括如下步骤：同步使用小鼠生物法、ELISA法及细胞F-actin检测法对采集的贝类样品分别进行腹泻性贝类毒素检测，并进行结果比对。采用双抗体夹心法原理定量检测样品中生物毒素；用制备的试纸条检测样品中的生物毒素，每一种毒素检测试纸条上均有对照线C和检测线T，不同毒素检测判断的原则相同。所述步骤C)选用不同浓度石房蛤毒素、虾夷扇贝毒素中的一种或几种浓度。
实施例2：
本发明牛奶中腹泻性贝类毒素含量检测方法，包括步骤：A)培养人HL-7702肝细胞，选用不同浓度的大田软海绵酸(okadaicacid，OA)染毒细胞，检测OA作用细胞后F-肌动蛋白(F-actin)解聚效应大小，从而建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线；B)根据HL-7702肝细胞的F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，建立腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测方法，确定可能的检出限范围；C)选择与腹泻性贝类毒素可能共存的成分：石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、软骨藻酸(domoicacid，DA)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin，YTX)中的一种或几种，分别以不同浓度作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性；D）将活化好的生物素溶解于DMSO中，使其浓度为2.5mg/mL，分装后，置于-20℃保存；每2mL浓度为5mg/mL的毒素单克隆抗体，在0.1MpH8.5的碳酸盐缓冲液中，透析过夜，第二天取出，备用；取透析好的毒素单克隆抗体1.6mL，约8mg，加1MpH8.5碳酸盐缓冲液300uL，混匀后，再加生物素500uL，室温搅拌2h；加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，4℃搅拌0.5小时；离心，弃上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，10℃搅拌2小时；弃上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，终体积为4mL，PAGE及ELISA检测产物效价。还包括如下步骤：同步使用小鼠生物法、ELISA法及细胞F-actin检测法对采集的贝类样品分别进行腹泻性贝类毒素检测，并进行结果比对。采用双抗体夹心法原理定量检测样品中生物毒素；用制备的试纸条检测样品中的生物毒素，每一种毒素检测试纸条上均有对照线C和检测线T，不同毒素检测判断的原则相同。所述步骤C)选用不同浓度石房蛤毒素、虾夷扇贝毒素中的一种或几种浓度。
实施例3：
本发明牛奶中腹泻性贝类毒素含量检测方法，包括步骤：A)培养人HL-7702肝细胞，选用不同浓度的大田软海绵酸(okadaicacid，OA)染毒细胞，检测OA作用细胞后F-肌动蛋白(F-actin)解聚效应大小，从而建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线；B)根据HL-7702肝细胞的F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，建立腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测方法，确定可能的检出限范围；C)选择与腹泻性贝类毒素可能共存的成分：石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、软骨藻酸(domoicacid，DA)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin，YTX)中的一种或几种，分别以不同浓度作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性；D）将活化好的生物素溶解于DMSO中，使其浓度为2.5mg/mL，分装后，置于-20℃保存；每2mL浓度为5mg/mL的毒素单克隆抗体，在0.1MpH8.5的碳酸盐缓冲液中，透析过夜，第二天取出，备用；取透析好的毒素单克隆抗体1.6mL，约8mg，加1MpH8.5碳酸盐缓冲液300uL，混匀后，再加生物素500uL，室温搅拌2h；加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，4℃搅拌0.5小时；离心，弃上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，10℃搅拌1.5小时；弃上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，终体积为4mL，PAGE及ELISA检测产物效价。还包括如下步骤：同步使用小鼠生物法、ELISA法及细胞F-actin检测法对采集的贝类样品分别进行腹泻性贝类毒素检测，并进行结果比对。采用双抗体夹心法原理定量检测样品中生物毒素；用制备的试纸条检测样品中的生物毒素，每一种毒素检测试纸条上均有对照线C和检测线T，不同毒素检测判断的原则相同。所述步骤C)选用不同浓度石房蛤毒素、虾夷扇贝毒素中的一种或几种浓度。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。