一种检测饲料中多种脂溶性维生素的方法与流程

本发明涉及一种色谱检测分析方法，特别涉及一种检测维生素的色谱检测方法，对于脂溶性维生素具有良好的检测分析效率，属于化学成分分析技术领域。

背景技术：

脂溶性维生素包括VA、VD、VE、VK，由于其化学结构多含疏水性的烃链，不溶于水，易溶于有机溶剂。由于溶解性的差异，其检测方法与水溶性维生素也有所不同，特别是样品前处理所用的试剂类型，应当与有机溶剂为主。

目前关于水溶性维生素的检测方法相对完整，如滴定法、比色法、分光光度法以及上文中提到的高效液相色谱法和反相高效液相色谱法等。而对于脂溶性维生素来说，尽管存在检测单一成分的方法，但同时检测的方法相对较少。

王海凤等2006年建立了高效液相色谱法同时检测注射用复方维生素中维生素A棕榈酸酯、维生素D₂、维生素E、维生素K1的含量，各维生素的平均回收率分别为99.7％，98.4％，100.8％和98.5％，方法操作简便，结果准确。

刘红河等2005年建立反相高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)同时测定食品中维生素A、维生素D和维生素E(α-生育酚)的含量。该方法将食品样品加入乙醇、氢氧化钾及焦性没食子酸，80℃水浴皂化30min，石油醚提取后，氮气吹扫浓缩致干后用流动相溶解，用Supelco C18柱(15cm×4.6mm，5um)色谱柱，以甲醇为流动相，在325nm(VA)、265nm(VD)、294nm(VE)检测波长下进行检测。

谭青松等2007年采用一次进样同时检测鱼体组织中的维生素A、维生素D3和维生素E的方法。以石油醚提取鱼体组织中的脂溶性维生素，用VARIAN Res Elut 5μCl8 90A色谱柱，流动相为甲醇-水，此条件下对提取物中的3种脂溶性维生素能够进行良好的分离。结果表明，在292nm波长下，维生素A、维生素D3和维生素E线性关系良好。以石油醚提取鱼体组织中的脂溶性维生素，采用反相高效液相色谱仪在波长292nm处可同时对鱼体组织中维生素A、维生素D3和维生素E进行较好的分离和测定。

宋金春等2007年建立以高效液相色谱法同时测定注射用12种复合维生素中维生素D2、维生素A与维生素E含量的方法。方法以色谱柱为Inertsil(ODS-2)C18，流动相为乙腈-甲醇-二氯甲烷(80:10:10)，结果表明：维生素D2、维生素E醋酸酯与维生素A棕榈酸酯检测浓度的线性范围分别为0.61～1.43μg/mL、222.6-519.4μg/mL和1.21-2.82mg/mL；平均回收率分别为99.79％、99.53％、101.63％。

卢燕等2012年采用双三元高效液相色谱多阀多柱技术，对同一样品中水溶性维生素和脂溶性维生素不同方法处理得到的样品进行双进样，可同时分析样品中21种维生素。各维生素的方法检出限可达0.002～0.223μg.mL-1范围，本方法可用于多种样品的维生素检测和分析工作。

多种脂溶性维生素的同时测定的方法有：Kareti Srinivasa Rao等采用高效液相色谱法测定同时测定了药片中维生素A和维生素E的含量。王海凤等建立了高效液相色谱法同时检测注射用复方维生素中维生素A棕榈酸酯、维生素D₂、维生素E、维生素K1的含量的方法。刘红河等建立反相高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)同时测定食品中维生素A、维生素D和维生素E的含量。该方法将食品样品加入乙醇、氢氧化钾及焦性没食子酸，水浴皂化，石油醚提取后，氮气吹扫浓缩致干后用流动相溶解，用Supelco C18色谱柱，以甲醇为流动相，在不同检测波长下检测。

谭青松等采用一次进样同时检测了鱼体组织中的维生素A、维生素D₃和维生素E。该方法以石油醚提取鱼体组织中的脂溶性维生素，用VARIAN Res Elut 5μCl8 90A色谱柱，甲醇-水为流动相，在292nm波长下，维生素A、维生素D₃和维生素E线性关系良好。上述多种脂溶性维生素的同时测定的文献显示，通过色谱柱、流动相及检测器的优化组合，部分脂溶性维生素的同时检测是可行的。

随着畜牧业的不断发展，畜禽养殖的逐渐规模化，为了满足日益增长的畜禽消费需求，畜禽的营养和健康越来越受到关注。维生素作为一种重要的维持动物机体健康的物质，在畜禽饲料中是不可或缺的。饲料中的各种维生素的量必须达到动物体的需要量，才能保证动物的健康生长和生产产品。

畜牧业使用的配合饲料/原料多具有成分复配、组方复杂的特点，及包括了基础原料中所含有的分散于原料内的维生素成分，又包括了人为主动添加的混合维生素成分。加之复合饲料中各种成分之间的相互作用影响，使得配合饲料中的脂溶性维生素成分的精确检测分析变得十分困难。现有的针对于食品、肉类中所含有的多种脂溶性维生素检测方法难以适用于这类复杂的情况，因而不得不采用一一检测、单独分析的方法对配合饲料进行检测分析，导致配合饲料的检测分析工作十分繁琐复杂，耗时长，工作效率较低，不利于饲料生产企业以及饲料应用企业对于饲料的品质控制。所以，目前关于多种脂溶性维生素同时检测方法的有待研究，准确、便捷地测定饲料中多种脂溶性维生素含量方法亟待研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中缺少针对于配合饲料中复杂情况下的多种脂溶性维生素同时检测分析的方法，使得检测分析配合饲料的耗时长、效率低的不足，提供一种检测饲料中多种脂溶性维生素的方法。本发明方法采用高效液相色谱串联质谱/质谱的检测分析方法(HPLC-MS/MS)，结合配合饲料的成分特点以及脂溶性维生素的理化性质，设计相应的原料预处理以及上样检测分析的流程，实现了一次性检测完成多种不同的维生素的分析的效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种检测饲料中多种脂溶性维生素的方法，包括以下步骤：

(1)根据检测需要，制备多种维生素标准溶液，包括以下维生素中的至少两种以上：维生素A醋酸酯、维生素D₃、维生素E乙酸酯。

采用HPLC-MS/MS检测标准溶液，得到标准曲线方程。

色谱条件如下：

色谱柱：C18柱；

流动相包括流动相A：甲醇水溶液相，和流动相B：甲酸水溶液相。

其中流动相A：甲醇水溶液中甲醇的体积比例大于95％，流动相B：甲酸水溶液中甲酸的含量低于1wt％。

采用梯度洗脱，梯度条件：0～2min，流动相A 50～100％；2～9min，流动相A 100％；9～9.5min，流动相A 100～50％。

(2)称取样品，优选称取5-10g样品，到棕色容量瓶中，优选使用100毫升棕色容量瓶，加入提取溶液超声提取10-30min，优选为20min，冷却定容，离心，用0.22μm有机相滤膜，过滤上机，采用与步骤1相同的色谱参数(包括梯度洗脱程序)和质谱检测参数进行分析测试。

所述提取溶液是，由提取溶液第一组分和提取溶液第二组分按照25-35：65-75体积比例混合配制而成的溶液。

所述提取溶液第一组分是0.03-0.07％氨水溶液(重量比，wt％)。

所述提取溶液第二组分是0.1-0.3％BHT甲醇溶液(m/vol，g/L)。

(3)根据步骤1和步骤2的检测结果计算得出样品中的多种维生素的含量。

本发明的检测方法设计了氨水溶液和甲醇溶液的混合提取溶液，具有针对性和选择，能够有效的将配合饲料复杂成分中多种维生素成分充分提取，然后通过梯度洗脱的方式，使得几种不同的脂溶性维生素快速的分离开来，达到所需要的一次性检测分析多种脂溶性维生素的目的。克服了现有技术中对于多种不同的脂溶性维生素难以在一次检测分析中完成高效率、高准确率检测的不足，减少检测分析耗时，避免现有国标检测方法所存在的工作繁琐的缺陷。

进一步，标准溶液制备：先用甲醇溶解维生素，配制成质量浓度为1g/L的标准物质储备溶液，然后稀释成分标准工作溶液。标准储备溶液中加入0.2wt％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。优选的，稀释过程中应用的是提取溶液进行稀释。经过稀释后的溶液与待测试的样品的性质最为接近有利于提高检测结果的准确性。

进一步，所述提取溶液第一组份是：0.05％氨水溶液；所述提取溶液第二组分是：0.2％(m/vol，g/L)BHT甲醇。优选的，提取溶液第一组份和提取溶液第二组分的体积比为30：70。

进一步，采用梯度洗脱过程中，流动相有两种，分别是：流动相A：含0.01-0.03％氨水的96-99％甲醇水溶液，流动相B：0.01-0.03％甲酸水溶液。

进一步，梯度洗脱程序为：流动相A：含0.02％氨水的98％甲醇水溶液，流动相B：0.02％甲酸水溶液，流速为0.3mL/min。

进一步，色谱条件中，色谱柱为以下之一：C18-MGⅡ(pH 2-10)3μm 2.0mm I.D.×150mm柱、C18-MGⅢ(pH 2-10)3μm 2.0mm I.D.×150mm柱、ADME(pH 2-10)3μm 2.1mm I.D.×150mm柱、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 2.1×50mm柱、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 3.0×50mm柱、Waters ACQUITY UPLC BEH 1.7μm 2.1×50mm柱。优选色谱柱为Capcell PAK ADME 2.1mm I.D×150mm，3μm(即ADME(pH 2-10)3μm 2.1mmI.D.×150mm柱，其使用pH范围为2-10)。

进一步，质谱条件为，ESI正离子扫描模式：多反应监测(MRM)参数：干燥气温度325℃，干燥气流速11L/min，雾化气压力45psi，鞘气温度300℃，流速9L/min，毛细管电压4000V，喷嘴电压500V。

进一步，质谱仪检测分析过程中，MRM监测模式下多种维生素的检测参数条件如表2所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1.本发明的同时检测配合饲料中的多种脂溶性维生素的方法，根据配合饲料样品中复杂的维生素源情况和脂溶性维生素的理化性质，设计了相应的提取萃取方法和HPLC-MS/MS的色谱条件和质谱条件，在一次检测分析过程中完成多种不同的维生素的检测分析。

2.本发明的检测方法中采用的提取溶液对于脂溶性维生素的选择性提取效率高，能够提高检测样品中的脂溶性维生素的提取率，使得结果更加准确。

3.本发明的检测方法中HPLC色谱中使用的流动相对于多种不同的脂溶性维生素的分离效果好，色谱分离后的样品在质谱仪中分析结果更加精确可靠，能够实现更高检测分析精度，无论是脂溶性维生素的定性测试还是定量分析都具有显著的进步提升。

附图说明：

图1是VA全扫描的离子流图。

图2是VE全扫描的离子流图。

图3是VD₃全扫描的离子流图。

图4是同时检测三种脂溶性维生素的MRM图谱。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

1仪器和试剂

(1)Agilent 1260-6460液相色谱—三重四极杆串联质谱联用仪配电喷雾离子源ESI(美国安捷伦公司)；

(2)AB-135型电子分析天平(梅特勒托利多上海有限公司)。

(3)LD5-2B离心机(北京京立离心机有限公司)。

(4)KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

(5)旋涡混匀器MS3(德国IKA)。

(6)乙睛、甲醇(色谱纯，默克公司。

(7)甲酸、乙酸铵、氨水(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)。

(8)氢氧化钠、氯化钠(分析纯，上海国药集团)。

(9)维生素A醋酸酯(C₂₂H₃₂O₂，分子量：328.5)。

(10)维生素E乙酸酯(C₃₁H₅₂O₃，分子量：472.74)。

(11)维生素D3(C₂₇H₄₄O，分子量：384.63)。

2提取溶液和三种脂溶性维生素标准溶液的配制

2.1提取溶液的配制

提取溶液：0.2％(m/V)BHT+0.05％氨水甲醇溶液作为样品提取液。

2.2脂溶性维生素标准溶液的配制

标准物质储备溶液：准确称取100mg的维生素A醋酸酯、维生素E乙酸酯、维生素D₃标准品，用甲醇(加入0.2％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT))配制成质量浓度为1000.0mg/L的标准物质储备溶液。

标准物质工作中间液：准确分别移取适量的标准物质储备溶液，用上述2.1配制的提取溶液，配制成维生素A醋酸酯、维生素D3质量浓度为100mg/L、维生素E乙酸酯质量浓度为2mg/L的标准工作中间液。

标准物质工作液：分别吸取1mL各标准物质工作中间液，用2.1配制的提取溶液，配成浓度以维生素A醋酸酯、维生素D浓度为1mg/L、维生素E乙酸酯浓度为20μg/L的混合标准物质工作液。

标准系列的配制：取混合标准物质工作液2、4、10、20mL分别置于100mL棕色容量瓶中，用2.1配制的提取溶液，稀释成以维生素E乙酸酯计，浓度为0.4、0.8、2、4、20μg/L的标准系列。

3样品处理

称取5-10g样品到100毫升棕色容量瓶中，加入提取溶液超声提取20min，冷却定容，离心，用0.22μm有机相滤膜，过滤上机。

4色谱与质谱条件

4.1色谱条件

色谱柱：Capcell PAK ADME(2.1mm I.D×150mm，3μm)；流动相A：含0.02％氨水的98％甲醇水溶液，流动相B：0.02％甲酸水溶液，流速为0.3mL/min，运行14min，采用梯度洗脱程序，梯度条件为如表1所示。

表1流动相洗脱梯度

4.2质谱条件

ESI正离子扫描模式：多反应监测(MRM)参数：干燥气温度325℃，干燥气流速11L/min，雾化气压力45psi，鞘气温度300℃，流速9L/min，毛细管电压4000V，喷嘴电压500V，其他质谱优化条件如表2所示。

表2 MRM监测模式下三种脂溶性维生素的仪器优化条件

5结果与分析

5.1不同提取溶剂对3种脂溶性维生素检测结果的影响

比较甲醇、0.2％(m/Vol，g/L)碱性蛋白酶甲醇溶液、0.2％(m/V，g/L)BHT甲醇溶液、0.2％(m/V，g/L)BHT+0.05％氨水甲醇溶液几种提取剂分别对样品提取的效果。上机检测均能得到很好的分离，但日间重现性有显著差异，其中0.2％(m/V，g/L)BHT+0.05％氨水甲醇(V/V)溶液重现性好。然而，0.2％(m/V，g/L)BHT+0.05％氨水甲醇溶液作为流动相时，其各组分响应值达到最优，故选择用0.2％(m/V，g/L)BHT+0.05％氨水甲醇溶液作为样品提取液。

选定最终样品提取溶液以后，样品预处理的方法总结如下：称取饲料样品5～10g于100ml容量瓶中，加入0.2％(m/V，g/L)BHT+0.05％氨水甲醇溶液，超声提取20min，冷却定容，离心，用0.22μm有机相滤膜，过滤上机。

5.2不同色谱柱与流动相的选择对三种脂溶性维生素检测结果的影响

分别用：

C18-MGⅡ(pH 2-10)3μm 2.0mm I.D.×150mm柱、

C18-MGⅢ(pH 2-10)3μm 2.0mm I.D.×150mm柱、

ADME(pH 2-10)3μm 2.1mm I.D.×150mm柱、

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 2.1×50mm柱、

Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 3.0×50mm柱、

Waters ACQUITY UPLC BEH 1.7μm 2.1×50mm柱，

比较其分离效果，得出ADME(pH 2-10)3μm 2.1mm I.D.×150mm柱对脂溶性维生素有很好的保留。实验过程中，我们发现：当选用一般的C18色谱柱进行多种脂溶性维生素检测分析的时候，多种脂溶性维生素分离效果表现较为一般，检测分析的结果准确度不能达到最佳的预期效果。最终优选，发现采用ADME(pH 2-10)3μm 2.1mmI.D.×150mm柱的时候，色谱分析效果以及检测分析的准确度最佳，ADME(pH 2-10)3μm 2.1mmI.D.×150mm柱可以作为最佳的色谱条件，是本发明最优选应用的色谱柱条件，以下实验过程中均采用该色谱柱系统进行分离检测。

5.3不同质谱条件的选择对3种脂溶性维生素检测结果的影响

试验采用一定浓度的用0.2％(m/V)BHT+0.05％氨水甲醇溶液配制好的单一的脂溶性维生素标准工作液，在正离子模式下分别对其进行母离子MS2 SCAN，发现各目标物的[M+H]+分子离子峰强度都高，离子源的温度在260℃-350℃均无明显变化，故选仪器设定温度325℃作为离子源温度。然后做MS2 SIM优化Fragmentor，然后做Product lon，并优化Collision Energy，得出具有特征的定性离子和定量离子，得到离子流图谱如图1-图3(依次为VA、VE和VD₃全扫描的离子流图)，再进一步对干燥气流速，雾化气压力，鞘气温度，鞘气流速，毛细管电压，喷嘴电压进行优化。所以，最终的质谱条件参数如上4.2所述：干燥气温度325℃，干燥气流速11L/min，雾化气压力45psi，鞘气温度300℃，流速9L/min，毛细管电压4000V，喷嘴电压500V。

5.4线性范围、定量限、加标回收率及相对标准偏差

(1)线性范围

配制与待测样品相同基质的混合标准系列工作液，使其浓度为分别0.4、0.8、2、4、20μg/L(以VE((以维生素E乙酸酯计))计)，以选定的定量离子峰面积对质量浓度做标准曲线，3种脂溶性维生素的线性方程及相关系数如表3所示。结果显示，在3种脂溶性维生素在0.4～20μg/L(以VE(以维生素E乙酸酯计)计)范围内的线性相关系数(R²)为0.9995～0.9999，表明线性相关性良好。

表3种脂溶性维生素标准曲线及相关系数

(2)检出限和定量限

采用空白提取液中添加目标化合物的方法按1.2样品提取与净化进行处理后上机分析，以维生素E乙酸酯计，浓度为0.4μg/L得出的SNR。以3倍信噪比确定检出限，以10倍信噪比确定定量下限，通过计算得出6种水溶性维生素的检出限和定量限如表4所示。

表4检出限和定量限

(3)加标回收率及相对偏差

在溶剂空白中分别加入不同浓度的目标维生素标准品，按照1.2中样品前处理方法进行处理，上机检测其浓度，计算加标回收率，加标量、回收率及相对偏差如表5所示(n＝6)。

表5加标回收率及相对偏差

5.6实际样品的测定

应用上述方法对鱼料、肉鸡料、仔猪料、蛋鸡料、乳猪料和种猪料样品种的3种脂溶性维生素进行检测，同时检测三种脂溶性维生素的图谱如图4所示，同时检测三种脂溶性维生素的MRM图谱。

几种饲料样品中均能检测出维生素D₃、维生素E乙酸酯、维生素A乙酸酯，其中VD₃的含量为3731～18939μg/kg，VE(以维生素E乙酸酯计)含量为18576～38674μg/kg，维生素A乙酸酯的含量为12579～105648μg/kg。证明该方法切实可行。本方法能够满足配合饲料同时检测3种脂溶性维生素的需求。

具体的检测多种不同的样品的结果如下表6所示：

表6本发明方法检测多种不同的样品的结果

6对比国标检测方法

采用本试验中所建立的3种脂溶性维生素方法，在样品前处理时，只需要加0.2％(m/V)BHT+0.05％氨水甲醇溶液，即可达到3种脂溶性维生素同时提取的要求。通过加标回收试验的验证，该提取方法不仅简单易行，而且能够达到检测所要求的精度。国标法^[1-3]中，VA、VD₃和VE的检测，需要通过皂化后再进行提取，会用到无水乙醚；而且还需要旋转蒸发来进行浓缩，过程繁琐，毒性较大，也在造成环境压力，存在一定危险性。

此外，本试验采用质谱联用的方法对维生素进行检测，通过定性/定量离子对来确认维生素目标物，与国标法相比，本试验的方法所能达到的检出限和定量限更低，如表7所示，更利于低含量的维生素样品的检测。

表7本发明方法与国标法的检出限于定量限比较

单位：μg/kg

综上所述，与国标法相较而言，本发明方法大大缩短了样品前处理的时间和难度，为试剂检测工作提供了便捷，大大提高工作效率。同时，提取减少了有毒有害试剂(甲醇)的使用，对人员起到很好的保护作用。

结论：本试验建立了HPLC-MSMS同时检测鱼料、肉鸡料、仔猪料、蛋鸡料、乳猪料和种猪料等配合饲料中3种脂溶性维生素的分析方法，且用该方法检测3种脂溶性维生素的加标回收率为89.7％～98.8％，相对标准偏差(n＝6)为4.5％～9.8％，各脂溶性维生素的检出限为0.12～25.80μg/kg，定量下限为0.38～86.20μg/kg。该方法快捷、操作简单、节能环保、结果准确，符合相关法律法规的要求，满足日常检测需要。

备注：本文各种维生素含量均以质量分数计，如需转换为国际单位(IU)，转换系数如下:

1国际单位VA(IU)＝0.344μg维生素A乙酸酯。

1国际单位VE(IU)＝1mg维生素E乙酸酯。

1国际单位VD3(IU)＝0.025μg但胆钙化醇。

BHT：2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。

国标[1-3]是指：

饲料中维生素A的测定 高效液相色谱法GB/T17817-2010；

饲料中维生素D₃的测定 高效液相色谱法GB/T17818-2010；

饲料中维生素E的测定 高效液相色谱法GB/T17812-2008。