本发明涉及医学病理领域，尤其涉及一种快速、低毒的蚊虫石蜡切片制作方法。
背景技术：
石蜡切片法是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法，石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织形态变化的主要方法。石蜡切片法的基本过程是先将已经固定的送检组织经冲洗、脱水、透明、浸蜡，然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色，最终制成石蜡切片。
石蜡切片技术也是研究蚊虫组织形态及组织病理的重要实验技术。对于蚊虫的切片研究，对掌握蚊虫体内的病毒分布和机体结构具有重要的意义。但是，蚊虫虫外骨骼较为坚硬，水溶性固定液、脱水酒精等难以迅速、均一的渗透于整个蚊虫中，从而难以制作完整的石蜡切片。同时，蚊虫体内组织相对柔软，价值血淋巴的存在，致使组织像悬浮于流体物质中，若浸蜡不足，难以切出完整的切片。目前蚊虫石蜡切片方法多数用于蚊虫的局部组织或器官(如触角、消化道、足等)，这样不能观察到蚊虫整体的显微结构。针针对这种身体柔软、液体含量高、腔室比例大的幼虫虫体材料，埋、切片等的效果不够理想，最终切片对组织区分度十分有限，尤其是占虫体比例非常大的消化道容易变形或破碎，难以观察到虫体完整空间结构。
同时，传统制片方法中所采用的福尔马林、二甲苯等易挥发、有强烈的刺激性和高剧毒性，对病理工作人员的工作环境和生活环境都十分有害，长期接触福尔马林可能会引起慢性呼吸道疾病、癌症发生，导致记忆力和智力下降，严重时可出现胃肠穿孔、肝脏损害甚至昏迷；(2)传统的组织处理过程都是分步进行的，每个过程所需要的试剂量大，对操作人员的危害大；组织处理时间长，从取材到出报告需要3-5d的时间。
目前常规的切片方法不仅操作复杂，需要耗费较长时间，且常使用毒性大的二甲苯，易挥发、有强烈的刺激性和高剧毒性，对病理工作人员的工作环境和生活环境都十分有害，长期接触可能会引起慢性呼吸道疾病、癌症发生，导致记忆力和智力下降，严重时可出现胃肠穿孔、肝脏损害甚至昏迷。更重要的是最终固定、包埋、切片等的效果不够理想，最终切片对组织区分度十分有限，难以观察到虫体完整空间结构。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，一种快速、低毒的蚊虫石蜡切片制作方法，操作简单、耗时短，毒性低，且能观察到蚊虫体完整的空间结构。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种快速、低毒的蚊虫石蜡切片制作方法，包括以下步骤：
1)人工喂养 取若干只蚊虫，饥饿10-24h,放入蚊笼内，并放入蘸满小鼠血的海绵块，30min-60min后取出蚊虫。
2)取材与固定 将喂养后的蚊虫冻麻，然后去除腿和翅，放入固定液中固定，在负压下固定1h,继续室温下固定12-24h,用60％酒精清洗2-3次，然后保存在60％酒精中备用。
3)脱水、透明 取固定后的虫体，在4℃条件下，依次用浓度梯度为60％、70％、90％、100％Ⅰ、100％Ⅱ的乙醇溶液脱水，每个梯度的处理时间至少为1小时，最后加入到透明剂中加热煮沸，进行透明。100％Ⅰ、100％Ⅱ均为浓度为100％的乙醇。
4)透蜡、包埋 将3)中透明好的虫体，在负压条件下放入Hemo-De和石蜡1：1的混合溶液中浸泡20-40min,然后放入石蜡中浸泡30min-1h三次，完成透蜡过程，最后，放入硬蜡中完成包埋过程。Hemo-De为一种衍生于n-柠檬油精的透明剂。
5)切片 将4)中包埋好的石蜡块经过分割、修整与固着，然后经切片机将石蜡块切成5-8μm的切片，并展片。
6)染色 具体步骤为：采用苏木精染液染色2-3min,自来水冲洗5-10min,1％盐酸酒精5-10s,自来水洗3-5min，弱碱性水溶液显蓝30s,自来水洗5-10min,蒸馏水洗2-3次，0.25％水溶液伊红染液染色2-3min,蒸馏水洗1-2次,最后用梯度酒精脱水。
7)封片 采用松节油稀释的树胶封片。
作为一种优选的方案，步骤2)中，所述固定液为Bouin氏液或含4％甲醛的PBS溶液。
作为一种优选的方案，所述的Bouin氏液是由下列试剂按体积比配制而成：饱和苦味酸15份，福尔马林5份，冰醋酸1份。
作为一种优选的方案，步骤3)中，所述透明剂为甲基环己烷、氯仿或正丁醇中的一种。
作为一种优选的方案，步骤2)中的负压为-0.05～-0.3MPa，步骤4)中的负压为-0.1～-0.5MPa。
作为一种优选的方案，步骤4)中，所述虫体放入石蜡中浸泡30min-1h三次具体为在50-55℃下浸泡30min,55-58℃下浸泡30min,58-60℃下浸泡1h。
作为一种优选的方案，步骤5)中，所述切片机为轮转式石蜡切片机。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明涉及的石蜡切片制作方法，针对蚊虫外壁较硬，固定液难以迅速、均匀的渗透；同时，体内组织较柔软，透蜡不足则很难切片的特性，采取了一系列措施。首先，采取喂养后的蚊虫进行切片，更直观的观察蚊虫的肠和食道。然后，固定前去除蚊虫的脚和翅，一方面便于固定，另一方面加快后续的透蜡过程，保证透蜡的均匀性。同时，本制作方法的固定和透蜡过程均在负压下进行，组织和溶剂的阻力将至最低，更有利于固定液和石蜡的浸入，从而保证切片的顺利进行；还一定程度上较少了制片的时间，加快了工作效率。最后，本制作方法，采用的固定液、透明剂、封片剂等溶剂中并未使用二甲苯，，大大降低了对病理科技术人员的身体危害及对环境的污染。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种快速、低毒的蚊虫石蜡切片制作方法，包括以下步骤：
1)人工喂养 取若干只蚊虫，饥饿12h,放入蚊笼内，并放入蘸满小鼠血的海绵块，30min后取出蚊虫。
2)取材与固定 将喂养后的蚊虫冻麻，然后去除腿和翅，放入固定液Bouin氏液中固定，在负压下固定1h,继续室温下固定12h,用60％酒精清洗2次，然后保存在60％酒精(均指浓度)中备用。
3)脱水、透明 取固定后的虫体，在4℃条件下，依次用浓度梯度为60％、70％、90％、100％Ⅰ、100％Ⅱ的乙醇溶液脱水，每个梯度的处理时间为1小时，最后加入到透明剂甲基环己烷中加热煮沸，进行透明。
4)透蜡、包埋 将3)中透明好的虫体，在负压条件下放入Hemo-De和石蜡1：1的混合溶液中浸泡20min,然后放入石蜡中浸泡三次，三次具体为在50℃下浸泡30min,55℃下浸泡30min,58℃下浸泡1h完成透蜡过程，最后，放入硬蜡中完成包埋过程。
5)切片 将4)中包埋好的石蜡块经过分割、修整与固着，然后经轮转式石蜡切片机将石蜡块切成5μm的切片，并展片。
6)染色 具体步骤为：采用苏木精染液染色2min,自来水冲洗5min,1％盐酸酒精5s,自来水洗3min，弱碱性水溶液显蓝30s,自来水洗5min,蒸馏水洗2次，0.25％水溶液伊红染液染色2min,蒸馏水洗1次。染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95％及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底。
7)封片 采用松节油稀释的树胶封片，制成标本。
实施例2
一种快速、低毒的蚊虫石蜡切片制作方法，包括以下步骤：
1)人工喂养 取若干只蚊虫，饥饿18h,放入蚊笼内，并放入蘸满小鼠血的海绵块，60min后取出蚊虫。
2)取材与固定 将喂养后的蚊虫冻麻，然后去除腿和翅，放入固定液中固定，在负压-0.1MPa下固定1h,继续室温下固定15h,用60％酒精清洗3次，然后保存在60％酒精中备用。
3)脱水、透明 取固定后的虫体，在4℃条件下，依次用浓度梯度为60％、70％、90％、100％Ⅰ、100％Ⅱ的乙醇溶液脱水，每个梯度的处理时间为1小时，最后加入到透明剂中加热煮沸，进行透明。100％Ⅰ、100％Ⅱ均为浓度为100％的乙醇。
4)透蜡、包埋 将3)中透明好的虫体，在负压-0.3MPa条件下放入Hemo-De和石蜡1：1的混合溶液中浸泡30min,然后放入石蜡中浸泡三次，三次具体为在52℃下浸泡30min,55℃下浸泡30min,60℃下浸泡1h完成透蜡过程，完成透蜡过程，最后，放入硬蜡中完成包埋过程。Hemo-De为一种衍生于n-柠檬油精的透明剂。
5)切片 将4)中包埋好的石蜡块经过分割、修整与固着，然后经切片机将石蜡块切成8μm的切片，并展片。
6)染色 具体步骤为：采用苏木精染液染色3min,自来水冲洗10min,1％盐酸酒精10s,自来水洗5min，弱碱性水溶液显蓝30s,自来水洗10min,蒸馏水洗3次，0.25％水溶液伊红染液染色3min,蒸馏水洗2次,最后用梯度酒精脱水。
7)封片 松节油透明后，迅速擦去材料周围多余液体，滴加适量(1～2滴)中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本。