一种测定阿莫西林克拉维酸钾药物组合物中克拉维酸有关物质的液相色谱方法与流程

本发明属于药物杂质分析检测领域，具体涉及一种测定阿莫西林克拉维酸钾药物组合物中克拉维酸的有关物质的液相色谱方法。

背景技术：

阿莫西林是一种最常用的广谱β-内酰胺类抗生素，其杀菌作用和穿透细胞膜的能力强，但其对β-内酰胺酶不稳定。克拉维酸属于不可逆性竞争型β-内酰胺酶抑制剂，两者合用，可保护阿莫西林免遭β-内酰胺酶水解，使阿莫西林的抗菌作用显著增强。临床上将其广泛用于各种感染性疾病的治疗。

克拉维酸钾(clavulanatepotassium)的化学结构式为：

本领域已知，克拉维酸钾化学性质不稳定，在生产和储存过程中容易降解导致含量降低，引入杂质，从而影响药物的安全与疗效。

目前，阿莫西林克拉维酸钾药物组合物有关物质检测方法在usp41、bp2018、中国药典(2015年版)均有收载，但质量标准中控制的杂质多是阿莫西林的降解杂质，针对该品种中克拉维酸有关物质检测方法则鲜有报道。已公开的克拉维酸有关物质测定方法为hplc法(见中国药典2015年版二部)，经研究发现，在实验操作过程中，上述方法容易受到主成分阿莫西林及药物组合物中其它杂质的干扰。因此，为保证药物的安全性和有效性，有必要开发一种针对阿莫西林克拉维酸药物组合物中克拉维酸有关物质的检测方法。

技术实现要素：

发明目的：为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种测定阿莫西林克拉维酸钾药物组合物中克拉维酸有关物质的检测方法，所述方法能够准确测定克拉维酸杂质a(降解杂质)、b(降解杂质)、c(降解杂质)、d(降解杂质)和g(工艺杂质)的含量，克拉维酸杂质e(降解杂质)为中间态杂质，会进一步聚合成克拉维酸聚合物，仅作定性研究用。

技术方案：本发明所述测定阿莫西林克拉维酸钾药物组合物中克拉维酸有关物质的液相色谱方法，包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以醋酸铵水溶液为流动相a，醋酸铵水溶液-乙腈为流动相b，进行线性梯度洗脱，所述醋酸铵水溶液ph值为5.60～5.80。

其中，所述醋酸铵水溶液浓度为0.01～0.06mol/l，优选为0.02～0.05mol/l。

其中，所述醋酸铵水溶液的ph值为5.65～5.75。

其中，流动相b中醋酸铵水溶液与乙腈的体积比为(75～85):(15～25)，优选醋酸铵水溶液与乙腈的体积比为80:20。

优选地，十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱是watersatlantist3。

其中，检测波长为212nm～216nm，流动相的流速为0.8～1.2ml/min，色谱柱温度为25℃～35℃，优选为28℃～32℃。

其中，线性梯度洗脱条件为：

0到10分钟：92％～95％流动相a，8％～5％流动相b；

10到50分钟，(92％～95％)→0流动相a，(8％～5％)→100％流动相b。

优选地，线性梯度洗脱条件为：

0到10分钟：92％～95％流动相a，8％～5％流动相b；

10到50分钟，(92％～95％)→0流动相a，(8％～5％)→100％流动相b；

50到51分钟，0→(92％～95％)流动相a，100％→(8％～5％)流动相b；

51到60分钟，92％～95％流动相a，8％～5％流动相b。

优选地，线性梯度洗脱条件为：

0到10分钟：94％流动相a，6％流动相b；

10到50分钟，94％→0流动相a，6％→100％流动相b；

50到51分钟，0→94％流动相a，100％→6％流动相b。

所述克拉维酸有关物质包括上述克拉维酸杂质a～g。

所述阿莫西林克拉维酸钾药物组合物中，阿莫西林与克拉维酸钾的重量比为1:1～16:1，优选为4:1。

所述测定阿莫西林克拉维酸钾药物组合物中克拉维酸有关物质的液相色谱方法，包括将待测样品溶于流动相中，得到待测溶液，所述待测溶液的质量浓度按克拉维酸计为0.4mg/ml～0.6mg/ml。

优选地，所述醋酸铵水溶液用冰醋酸调节ph值。

所述方法采用紫外检测器进行定量分析。

优选地，所述的方法包含以下步骤：

(1)取待测样品溶于流动相中，得到待测溶液，所述待测溶液的质量浓度按克拉维酸计为0.4mg/ml～0.6mg/ml；

(2)设置流动相的流速为0.8～1.2ml/min；检测波长为212nm～216nm；色谱柱柱温箱温度为25℃～35℃，优选为28℃～32℃。

有益效果：

1、本发明提供的方法能够使克拉维酸容易地与杂质a、b、c、d、e、g分离，而不受阿莫西林及药物组合物中其它杂质的干扰，从而提高了对克拉维酸检测的准确性，有利于对产品质量进行控制。实验结果表明，本发明提供的方法得到的检测结果中，克拉维酸与杂质a～g的色谱峰之间分离度均大于1.5。

2、本发明提供的方法还能够同时将阿莫西林及药物组合物中其它杂质分离开，对克拉维酸及其已知杂质a～g的检测无影响。

3、本发明提供的方法能够有效检出阿莫西林克拉维酸钾药物组合物中的克拉维酸杂质，分离度高，简单易行且分析成本低，结果准确可靠，便于生产和质控过程中产品质量的控制。

附图说明

图1为本发明实施例1得到的克拉维酸杂质a对照品的高效液相色谱图；

图2为本发明实施例1得到的克拉维酸杂质b对照品的高效液相色谱图；

图3为本发明实施例1得到的克拉维酸杂质c对照品的高效液相色谱图；

图4为本发明实施例1得到的克拉维酸杂质d对照品的高效液相色谱图；

图5为本发明实施例1得到的克拉维酸杂质e对照品的高效液相色谱图；

图6为本发明实施例1得到的克拉维酸杂质g对照品的高效液相色谱图；

图7为本发明实施例1得到高效液相色谱图；

图8为本发明实施例2得到高效液相色谱图；

图9为本发明实施例3得到高效液相色谱图；

图10为本发明实施例4得到高效液相色谱图；

图11为本发明实施例5得到高效液相色谱图；

图12为本发明实施例6得到高效液相色谱图；

图13为本发明实施例7得到高效液相色谱图；

图14为本发明实施例8得到高效液相色谱图；

图15为本发明实施例9得到高效液相色谱图；

图16为本发明实施例10得到高效液相色谱图；

图17为本发明实施例11得到高效液相色谱图；

图18为本发明实施例12得到高效液相色谱图；

图19为本发明实施例13得到高效液相色谱图；

图20为本发明实施例14得到高效液相色谱图；

图21为本发明实施例15得到高效液相色谱图；

图22为本发明实施例16得到高效液相色谱图。

具体实施方式

以下通过实施例形式对上述内容作进一步补充说明，但不应理解为对本发明保护范围的限定。以下实施例所述的阿莫西林克拉维酸钾药物组合物中阿莫西林和克拉维酸钾的重量比为4:1。

实施例1

实验仪器与条件：

agilent高效液相色谱仪；dad检测器；以watersatlantist3，5μm，250×4.6mm为分离柱。

检测条件：

流速：1.0ml/min；检测波长：214nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相a：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)；流动相b：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)，按表1进行线性梯度洗脱：

表1梯度洗脱程序

实验步骤：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)为流动相a，以0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)为流动相b，按表1中梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温为30℃；分别取克拉维酸杂质a、b、c、d、e、g对照品适量，加溶剂[流动相a-流动相b(94:6)]溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为各杂质的对照品贮备液；取阿莫西林克拉维酸钾药物组合物，加入各杂质对照品贮备液适量，加溶剂溶解并稀释，得到每1ml含克拉维酸0.5mg和杂质a、b、c、d、e、g各5μg的混合物待测溶液。

将上述各杂质对照品的贮备液和混合物待测溶液分别注入高效液相色谱仪中，进样体积为20μl，得到高效液相色谱图，记录色谱图，见附图1～7。

实施例2

实验仪器与条件：

agilent高效液相色谱仪；dad检测器；以watersatlantist3，5μm，250×4.6mm为分离柱。

检测条件：

流速：0.8ml/min；检测波长：214nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相a：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)；流动相b：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)，按表2进行线性梯度洗脱：

表2梯度洗脱程序

实验步骤：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)为流动相a，以0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)为流动相b，按表2中梯度洗脱，流速为0.8ml/min，检测波长为214nm，柱温为30℃；取阿莫西林克拉维酸钾药物组合物、克拉维酸杂质a、b、c、d、e、g对照品，加溶剂[流动相a-流动相b(94:6)]溶解，得到每1ml含克拉维酸0.5mg和杂质a、b、c、d、e、g各5μg的混合物待测溶液。

将上述混合物待测溶液注入高效液相色谱仪中，进样体积为20μl，得到高效液相色谱图，记录色谱图，见附图8。

实施例3

实验仪器与条件：

agilent高效液相色谱仪；dad检测器；以watersatlantist3，5μm，250×4.6mm为分离柱。

检测条件：

流速：1.2ml/min；检测波长：214nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相a：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)；流动相b：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)，按表3进行线性梯度洗脱：

表3梯度洗脱程序

实验步骤：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)为流动相a，以0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)为流动相b，按表3中梯度洗脱，流速为1.2ml/min，检测波长为214nm，柱温为30℃；取阿莫西林克拉维酸钾药物组合物、克拉维酸杂质a、b、c、d、e、g对照品，加溶剂[流动相a-流动相b(94:6)]溶解，得到每1ml含克拉维酸0.5mg和杂质a、b、c、d、e、g各5μg的混合物待测溶液。

将上述混合物待测溶液注入高效液相色谱仪中，进样体积为20μl，得到高效液相色谱图，记录色谱图，见附图9。

实施例4

与实施例1相同，区别仅在于，柱温为28℃，分离结果见附图10。

实施例5

与实施例1相同，区别仅在于，柱温为32℃，分离结果见附图11。

实施例6

实验仪器与条件：

agilent高效液相色谱仪；dad检测器；以watersatlantist3，5μm，250×4.6mm为分离柱。

检测条件：

流速：1ml/min；检测波长：214nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相a：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.65)；流动相b：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.65)-乙腈(80:20)，按表4进行线性梯度洗脱：

表4梯度洗脱程序

实验步骤：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.65)为流动相a，以0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.65)-乙腈(80:20)为流动相b，按表4中梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温为30℃；取阿莫西林克拉维酸钾药物组合物、克拉维酸杂质a、b、c、d、e、g对照品，加溶剂[流动相a-流动相b(94:6)]溶解，得到每1ml含克拉维酸0.5mg和杂质a、b、c、d、e、g各5μg的混合物待测溶液。

将上述混合物待测溶液注入高效液相色谱仪中，进样体积为20μl，得到高效液相色谱图，记录色谱图，见附图12。

实施例7

实验仪器与条件：

agilent高效液相色谱仪；dad检测器；以watersatlantist3，5μm，250×4.6mm为分离柱。

检测条件：

流速：1ml/min；检测波长：214nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相a：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.75)；流动相b：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.75)-乙腈(80:20)，按表5进行线性梯度洗脱：

表5梯度洗脱程序

实验步骤：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.75)为流动相a，以0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.75)-乙腈(80:20)为流动相b，按表5中梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温为30℃；取阿莫西林克拉维酸钾药物组合物、克拉维酸杂质a、b、c、d、e、g对照品，加溶剂[流动相a-流动相b(94:6)]溶解，得到每1ml含克拉维酸0.5mg和杂质a、b、c、d、e、g各5μg的混合物待测溶液。

将上述混合物待测溶液注入高效液相色谱仪中，进样体积为20μl，得到高效液相色谱图，记录色谱图，见附图13。

实施例8

实验仪器与条件：

agilent高效液相色谱仪；dad检测器；以watersatlantist3，5μm，250×4.6mm为分离柱。

检测条件：

流速：1ml/min；检测波长：214nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相a：0.02mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)；流动相b：0.02mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)，按表6进行线性梯度洗脱：

表6梯度洗脱程序

实验步骤：0.02mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)为流动相a，以0.02mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)为流动相b，按表6中梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温为30℃；取阿莫西林克拉维酸钾药物组合物、克拉维酸杂质a、b、c、d、e、g对照品，加溶剂[流动相a-流动相b(94:6)]溶解，得到每1ml含克拉维酸0.5mg和杂质a、b、c、d、e、g各5μg的混合物待测溶液。

将上述混合物待测溶液注入高效液相色谱仪中，进样体积为20μl，得到高效液相色谱图，记录色谱图，见附图14。

实施例9

实验仪器与条件：

agilent高效液相色谱仪；dad检测器；以watersatlantist3，5μm，250×4.6mm为分离柱。

检测条件：

流速：1ml/min；检测波长：214nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相a：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)；流动相b：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)，按表7进行线性梯度洗脱：

表7梯度洗脱程序

实验步骤：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)为流动相a，以0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)为流动相b，按表7中梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温为30℃；取阿莫西林克拉维酸钾药物组合物、克拉维酸杂质a、b、c、d、e、g对照品，加溶剂[流动相a-流动相b(94:6)]溶解，得到每1ml含克拉维酸0.5mg和杂质a、b、c、d、e、g各5μg的混合物待测溶液。

将上述混合物待测溶液注入高效液相色谱仪中，进样体积为20μl，得到高效液相色谱图，记录色谱图，见附图15。

实施例10

实验仪器与条件：

agilent高效液相色谱仪；dad检测器；以watersatlantist3，5μm，250×4.6mm为分离柱。

检测条件：

流速：1ml/min；检测波长：214nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相a：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)；流动相b：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)，按表8进行线性梯度洗脱：

表8梯度洗脱程序

实验步骤：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)为流动相a，以0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)为流动相b，按表8中梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温为30℃；取阿莫西林克拉维酸钾药物组合物、克拉维酸杂质a、b、c、d、e、g对照品，加溶剂[流动相a-流动相b(94:6)]溶解，得到每1ml含克拉维酸0.5mg和杂质a、b、c、d、e、g各5μg的混合物待测溶液。

将上述混合物待测溶液注入高效液相色谱仪中，进样体积为20μl，得到高效液相色谱图，记录色谱图，见附图16。

实施例11

实验仪器与条件：

agilent高效液相色谱仪；dad检测器；以watersatlantist3，5μm，250×4.6mm为分离柱。

检测条件：

流速：1ml/min；检测波长：214nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相a：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)；流动相b：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)，按表9进行线性梯度洗脱：

表9梯度洗脱程序

实验步骤：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)为流动相a，以0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)为流动相b，按表9中梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温为30℃；取阿莫西林克拉维酸钾药物组合物、克拉维酸杂质a、b、c、d、e、g对照品，加溶剂[流动相a-流动相b(94:6)]溶解，得到每1ml含克拉维酸0.5mg和杂质a、b、c、d、e、g各5μg的混合物待测溶液。

将上述混合物待测溶液注入高效液相色谱仪中，进样体积为20μl，得到高效液相色谱图，记录色谱图，见附图17。

实施例12

实验仪器与条件：

agilent高效液相色谱仪；dad检测器；以watersatlantist3，5μm，250×4.6mm为分离柱。

检测条件：

流速：1ml/min；检测波长：214nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相a：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)；流动相b：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)，按表10进行线性梯度洗脱：

表10梯度洗脱程序

实验步骤：0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)为流动相a，以0.05mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)为流动相b，按表10中梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温为30℃；取阿莫西林克拉维酸钾药物组合物、克拉维酸杂质a、b、c、d、e、g对照品，加溶剂[流动相a-流动相b(94:6)]溶解，得到每1ml含克拉维酸0.5mg和杂质a、b、c、d、e、g各5μg的混合物待测溶液。

将上述混合物待测溶液注入高效液相色谱仪中，进样体积为20μl，得到高效液相色谱图，记录色谱图，见附图18。

实施例13

实验仪器与条件：

agilent高效液相色谱仪；dad检测器；以watersatlantist3，5μm，250×4.6mm为分离柱。

检测条件：

流速：1.0ml/min；检测波长：214nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相a：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)；流动相b：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)，按表11进行线性梯度洗脱：

表11梯度洗脱程序

实验步骤：0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)为流动相a，以0.03mol/l醋酸铵水溶液(用冰醋酸调节ph值至5.70)-乙腈(80:20)为流动相b，按表11中梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温为30℃；取阿莫西林克拉维酸钾药物组合物、克拉维酸杂质a、b、c、d、e、g对照品，加溶剂[流动相a-流动相b(94:6)]溶解，得到每1ml含克拉维酸0.5mg和杂质a、b、c、d、e、g各5μg的混合物待测溶液。

将上述混合物待测溶液注入高效液相色谱仪中，进样体积为20μl，得到高效液相色谱图，记录色谱图，见附图19。

实施例14

与实施例13相同，区别仅在于，流动相ph为5.65，分离结果见附图20。

实施例15

与实施例13相同，区别仅在于，流动相ph为5.75，分离结果见附图21。

实施例16

与实施例13相同，区别仅在于，流动相ph为5.9，分离结果见附图22。

表12实施例2、3、9的hplc结果的比较

表13实施例1、8、9的hplc结果的比较

表14实施例1、4、5的hplc结果的比较

表15实施例1、6、7、8的hplc结果的比较

表16实施例13、14、15、16的hplc结果的比较

表17实施例1中主成分及各杂质的线性结果

注：克拉维酸杂质e为中间态杂质，会进一步聚合成克拉维酸聚合物，未进行此项试验，做定性研究。

表18实施例1中各杂质的加样回收率结果

注：克拉维酸杂质e为中间态杂质，会进一步聚合成克拉维酸聚合物，未进行此项试验，做定性研究。

表19实施例1中各杂质的精密度试验结果

注：克拉维酸杂质e为中间态杂质，会进一步聚合成克拉维酸聚合物，未进行此项试验，做定性研究。