奇亚籽中不饱和脂肪酸的快速测定方法与流程

本发明涉及奇亚籽中不饱和脂肪酸的快速测定方法，属于不饱和脂肪分析检测领域。

背景技术：

奇亚籽(chiaseed)原产于墨西哥南部和一些北美洲地区，是薄荷类植物芡欧鼠尾草(salviahispanical.)的种子，由于芡欧鼠尾草适应在墨西哥及北美洲地区海拔约1200m的高原荒漠地区生长，且国内并没有此物种的繁殖地，目前国内市场上的奇亚籽均依赖于进口，样品收集不易。

奇亚籽富含一般谷物中稀有n-3系列不饱和脂肪酸(亚麻酸)、膳食纤维、高品质的蛋白质、矿物质和维生素e12，正以一款新型超级食物打入国内市场。奇亚籽中脂肪含量30％左右，其中不饱和脂肪酸占比高于80％，奇亚籽油中单不饱和脂肪酸只是油酸，含量为2.43％，多不饱和脂肪酸主要是α-亚麻酸和亚油酸，含量分别为68％和20％，相比来会说奇亚籽油中的多不饱和脂肪酸含量远高于绝大多数食用油，奇亚籽中的不饱和脂肪酸含量可认为主要是油酸、α-亚麻酸和亚油酸的总量。因为这些必需脂肪酸的存在，可预防心脑血管疾病的发生，降低血压，调节血脂，预防血栓的生成等功效。

结合样品收集方面的原因，不饱和脂肪酸含量测定的常规方法为气相分析法，不饱和脂肪酸的检测方法较繁琐，耗时较长，虽然结果准确，仍然需注意细节，以保证实验数据的准确性。所以寻求一种快速、有效、无损的检测方法对奇亚籽不饱和脂肪酸含量的测定具有重要的现实意义。

近红外光谱(nearinfraredspectroscopy，nirs)是基于可见光和中红外光谱之间的一段光谱，波长范围为780nm-2526nm，属于分子振动光谱，是含氢基团(c-h、n-h、o-h)振动的倍频与合频吸收，是获取含氢基团特征信息的一种有效载体。随着化学计量学的加入，近红外光谱技术在农产品等食品检测中有着较多的应用，它的特点是：检测成本低，快速，无损害待检测样品，可实现在线检测，是一种成熟的食品品质分析技术。这为将该技术用于奇亚籽不饱和脂肪酸含量实时分析和监控成为一种可能。

目前已有利用近红外光谱检测不饱和脂肪酸含量的报道，比如王楠(基于近红外技术检测鱼油品质的研究，中国农业科学院)采集4000-12800cm^-1的光谱图，9219-4590cm^-1的区域作为建立定量分析模型的光谱区域，光谱经变量标准化处理后，所建立的定量分析模型稳定性较好；然而，该方法虽然可以较为准确的测定鱼油中的不饱和脂肪酸(dha和epa)含量，但是关于9219-4590cm^-1未进一步特定波段筛检，有效信息不够，可能含有冗杂信息，且由于物质环境不同，与不饱和脂肪酸相关的吸收波段差异较大，利用该方法中的波段数据无法建立奇亚籽中各不饱和脂肪酸准确的线性校正模型。此外，中国林业科学研究院林产化学工业研究所的王成章(cn102252995)建立了油酸、亚油酸等脂肪酸定量分析模型，针对不同的预处理应用不同波段选择；然而，该方法并未明确光谱数据如何构建校正模型，且该方法中的波段同样也无法有效、准确的预测奇亚籽中不饱和脂肪酸的含量。因此，开发一种快速、有效、无损且准确的奇亚籽中油酸、亚油酸和α-亚麻酸含量测定方法是十分重要的。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有奇亚籽中主要不饱和脂肪酸含量在分析过程中费时费力，检测周期长，样品破坏性测试，效果不佳的缺点，提供一种基于近红外光谱的奇亚籽中不饱和脂肪酸含量准确的建模方法和简便快速的检测方法，以评价奇亚籽的质量，用于奇亚籽加工品质的鉴别。

按照近红光谱产生的原理，4500cm^-1左右是-ch3、-ch2和c-h的伸缩振动的合频吸收；5800cm^-1左右是-ch3、-ch2和hc＝ch-的c-h伸缩振动的一级倍频吸收，根据各吸收峰强度值，以表征目标组分浓度特征，预处理后的光谱与实际测得的各不饱和脂肪酸含量参考值相关联，采用偏最小二乘法建立校正模型，这样就可以通过扫描奇亚籽的近红外光谱图，将相同预处理后的光谱调入校正模型，得到奇亚籽中的准确的各主要不饱和脂肪酸含量百分值。

本发明的第一个目的是提供一种测定奇亚籽中不饱和脂肪酸含量的方法，所述方法利用近红外光技术测定奇亚籽中油酸、亚油酸和α-亚麻酸的含量，包括如下步骤：

(1)在4000-10000cm^-1全光谱谱区范围内漫反射扫描奇亚籽样品，得到近红外光谱图；

(2)在所得近红外光谱图中选取4000-4800cm^-1、8000-8800cm^-1、9000-10000cm^-1中一种或多种组合作为特征波段范围，对特征波段范围内的光谱信息进行预处理，得到油酸峰强度值；在所得近红外光谱图中选取4000-6000cm^-1、6500-7400cm^-1中一种或两种组合作为特征波段范围，对特征波段范围内的光谱信息进行预处理，得到亚油酸峰强度值；在所得近红外光谱图中选取4000-4300cm^-1、4800-6000cm^-1、6800-9000cm^-1中一种或多种组合作为特征波段范围，对特征波段范围内的光谱信息进行预处理，得到α-亚麻酸峰强度值；所述预处理的方式包括多元散射校正(msc)、一阶导数(1st)、sg平滑和nd平滑中的一种或者多种；

(3)按国标方法分别测定奇亚籽样品中油酸、亚油酸、α-亚麻酸含量，作为参考值；并利用偏最小二乘法，与步骤(2)得到的相应油酸、亚油酸、α-亚麻峰强度值分别建立校正模型；

(4)待测样品经步骤(1)、(2)分别得到油酸、亚油酸、α-亚麻酸的峰强度值，根据步骤(3)中的相应的校正模型，计算得到待测样品样品中的油酸、亚油酸、α-亚麻酸的含量。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中油酸特定波段范围进一步优选4000-4800cm^-1、8000-8800cm^-1、9000-10000cm^-1的组合。

在本发明的一种实施方式中，亚油酸特定波段范围进一步优选4000-6000cm^-1、6500-7400cm^-1的组合。

在本发明的一种实施方式中，α-亚麻酸特定波段范围进一步优选4000-4300cm^-1、4800-6000cm^-1、6800-9000cm^-1的组合。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)是将奇亚籽样品置于样品杯中，在谱区范围内漫反射扫描，分辨率4-16cm^-1，扫描次数16-64次，增益4-8倍，得到近红外光谱。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)是将奇亚籽样品置于样品杯中，在谱区范围内漫反射扫描，分辨率8cm^-1，扫描次数32次，增益8倍，得到近红外光谱。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中油酸预处理的方式优选msc+sg平滑，或者多元散射校正。油酸预处理的方式优选msc+1st+sg平滑。α-亚麻酸预处理的方式优选msc+sg平滑，或者多元散射校正。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中油酸预处理的方式进一步优选msc+sg平滑。α-亚麻酸预处理的方式进一步优选msc+sg平滑。

在本发明的一种实施方式中，所述预处理中采用msc去除近红外漫反射光谱中样品的镜面反射及不均匀性造成的噪声和光谱的不重复性；采用一阶导数消除基线和提高分辨率、减少噪声干扰；采用sg平滑和/或nd平滑提高有效信息的信噪比。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中以偏最小二乘法建立校正模型，结合主成分分析对光谱信息进行降维压缩。

在本发明的一种实施方式中，油酸校正模型的主成分数为13。

在本发明的一种实施方式中，亚油酸校正模型的主成分数为4。

在本发明的一种实施方式中，α-亚麻酸校正模型的主成分数为9。

本发明的第二个目的是将上述检测方法应用于实时检测奇亚籽中主要不饱和脂肪酸含量变化中。

本发明的第三个目的是将上述检测方法应用于奇亚籽加工品质监测领域中。

本发明的有益效果是：

本发明首次将近红外光谱结合化学计量学方法引入奇亚籽主要的不饱和脂肪酸含量的无损检测，用于奇亚籽中不饱和脂肪酸的定量分析，方法准确，省时高效。

本发明与传统化学分析方法相比，检测速度快，不损坏样品，全程测定过程无需一分钟，是一种便捷方便、绿色环保的检测方法。

本发明方法将近红外光谱技术引入到奇亚籽数据库模型的搭建可以实现在线实时检测奇亚籽在加工过程中不饱和脂肪酸含量的变化，对确保奇亚籽加工品质的稳定性是十分有意义的。

附图说明

图1是近红外光谱技术建立pls模型的流程图；

图2是奇亚籽的原始近红外光谱图；

图3是3种不饱和脂肪酸rmsecv随主成分数的变化图；

图4是油酸的预测值与参考值的相关图；

图5是亚油酸的预测值与参考值的相关图；

图6是α-亚麻酸的预测值与参考值的相关图；

图7是3种不饱和脂肪酸内部交叉验证的结果图；

具体实施方式

下面以实施例的方式对本发明所述的近红外光谱模型建立及应用过程进一步说明，该实施例不应解释为对本发明的限制。

本发明所述的近红外光谱模型建立及应用过程如图1，具体如下：

1.代表性样品的收集及分类：

根据奇亚籽的生长环境和生长周期特点，分别收集各个奇亚籽主产地的样品，样品量达到86份，包括墨西哥、澳大利亚、阿根廷、玻利维亚、厄瓜多尔、尼加拉瓜、秘鲁等地区，收集周期大于二年(奇亚为薄荷类一年生植物)，多批次采集，收集种类包含黑奇亚籽和白奇亚籽两种类型。将样品分为校正样品集和验证样品集，每集涵盖各个地区、批次和颜色种类的奇亚籽，有效地拓展样品数据的范围。样品进行光谱采集的同时立即按国标方法测定奇亚籽中的各主要不饱和脂肪酸含量，建立奇亚籽样品油酸、亚油酸和α-亚麻酸含量的数据库。

2.仪器条件及样品光谱的采集：

仪器：近红外光谱由购自thermofisher科技(中国)有限公司的antarisii近红外分析仪扫描收集，该仪器配有光谱采集软件为result-integration；建模软件为tqanalyst，均为thermofisher科技(中国)有限公司开发。同时，配有ingaas检测器。

样品光谱的采集：在25℃±2℃的条件下对待测奇亚籽样品进行近红外光谱谱图的采集，称取25g籽粒于标准样品杯中，在选取的谱区范围内用漫反射的方式扫描奇亚籽样品的近红外光谱，分辨率8cm^-1，扫描次数32次，增益8×，同一样品倒出样品杯，重新装杯，如此扫描三次及以上，取平均光谱作为该样品的标准光谱。

3.参考值数据的测定：

参照gb5009.168-2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》，利用索氏提取法提取的油脂测定奇亚籽中油酸、亚油酸和α-亚麻酸的含量，进过一系列的皂化、甲酯化，于气相色谱仪中进样，以峰面积为基准定量测得油酸、亚油酸、α-亚麻酸的含量。每个样品检测三次，取平均值。

4.样品集划分：

将86个样品分成两组，一组为校正集，用于建立定量模型；另一组作为验证集，用于检验模型的准确性和稳定性。为了避免由于样品分组不合理而导致的偏差，子集选择如下进行：对于每4个样本，随机选择3个作为校正集，而剩余样本用作预测集。因此，本实验应用4个作为校正集，另外3个组成验证集。由表1所示，校正集样品的含量范围涵盖了验证集样品的含量范围，说明该分组结果较好。

表1校正集与验证集的样品数及含量

5.建立校正模型：

利用建模软件对光谱进行预处理，提取并放大表达奇亚籽不饱和脂肪酸含量的特征光谱信息。光谱预处理方法包括：为去除近红外漫反射光谱中样品的镜面反射及不均匀性造成的噪声，消除漫反射的基线及光谱的不重复性采用msc；为消除基线和提高分辨率采用了一阶导数，为减少噪声干扰；提高有效信息的信噪比采用sg平滑和nd平滑。同时结合主成分分析对光谱信息进行降维压缩，以偏最小二乘法建立校正模型。

6.内部交叉验证：

规定所有样品为校正集样品，采用留一法对模型进行内部交叉验证，即留下一份样品作为待预测样品，其余样品参与建模预测这一份样品不饱和脂肪酸含量，如此循环反复测得86份预测值与实际油酸、亚油酸和α-亚麻酸含量值的关系图，以相关系数rcv和交叉验证均方根误差(rootmeansquareerrorofcrossvalidation,rmsecv)评估模型。

7.进行样品预测：

在稳定的环境条件下，近红外分析仪中的卤钨灯光源发出光辐射，照射在奇亚籽样品上，漫反射出来的光被积分球收集，通过检测器将近红外光谱转化为数字信号传输到计算机，再用已建立和验证的校正模型对数字信号进行分析，从而得到奇亚籽中不饱和脂肪酸含量的数据。

实施例1：奇亚籽中油酸、亚油酸和α-亚麻酸含量校正模型的构建

(1)在25℃±2℃的条件下对待测奇亚籽样品(分为校正集与验证集)进行近红外光谱谱图的采集，称取25g籽粒于标准样品杯中，在4000-10000cm^-1谱区范围内用漫反射的方式扫描奇亚籽样品的近红外光谱，分辨率8cm^-1，扫描次数32次，增益8×，同一样品倒出样品杯，重新装杯，如此扫描三次及以上，取平均光谱作为该样品的标准光谱。

(2)油酸、亚油酸和α-亚麻酸分别选取对标准光谱中4000-4800、8000-8800、9000-10000cm^-1；4000-6000和6500-7400cm^-1；4000-4300、4800-6000和6800-9000cm^-1谱区范围内的光谱信息进行预处理，所述预处理方式分别为msc+sg、msc+sg+1st、msc+sg；

(3)奇亚籽样品按国标方法测定奇亚籽中的油酸、亚油酸和α-亚麻酸含量，得到样品实际含量值；提取步骤(2)中所述区间建立偏最小二乘法建立校正模型，得到预测值与实际油酸、亚油酸和α-亚麻酸含量值的线性模型；pls建模中油酸、亚油酸和α-亚麻酸r分别为0.9447、0.7576和0.9043，rmsec分别为0.10、0.23和0.76，rmsep分别为0.13、0.23和0.75，rpd分别为3.4、2.0和3.7，油酸和α-亚麻酸的预处理方法较好，r值均达到0.9以上，模型具有较好的预测精确度，可用于实际样品的定量测定，而亚油酸为0.7576，模型稍欠佳，但仍可以用于油酸含量的粗测。图4-6分别是油酸、亚油酸和α-亚麻酸校正集和验证集样品的预测值与实际不饱和脂肪酸含量值的相关图，其中，油酸的校正集和验证集的相关系数分别为0.9447和0.9539，亚油酸的校正集和验证集的相关系数分别为0.7576和7559，以及α-亚麻酸的校正集和验证集的相关系数分别为0.9043和0.8972，验证集均方根误差分别为0.10、0.23和0.76。

实施例2：奇亚籽不饱和脂肪酸含量校正模型的验证

设所有样品为校正集样品，采用留一法对模型进行内部交叉验证，即留下一份样品作为待预测样品，其余样品参与建模预测这一份样品不饱和脂肪酸含量，如此循环反复测得86份预测值，以相关系数rcv和rmsecv评估模型。

图7为用上述交叉验证后的校正集参考值(国标测定的含量)与nir预测值相关图，从图中可以很直观的看出，并没有较大偏离拟合直线的点，线性拟合良好。其中，油酸、亚油酸和α-亚麻酸rcv分别为0.9431、0.7707和0.8918，rmsecv分别为0.13、0.22和0.77。亚油酸r>0.75，模型有待提高；油酸和α-亚麻酸rcv在0.9左右，rmsecv较小，表明应用近红外光谱技术结合偏最小二乘法能够对奇亚籽中不饱和脂肪酸含量进行定量分析。

实施例3：光谱预处理方式对pls建模的影响

参考实施例1，将步骤(2)中的预处理方式替换为如表2所示的预处理方式，其他条件不变，进行pls建模。

表2选用不同预处理方法的奇亚籽不饱和脂肪酸含量pls建模结果

其中：raw：原始光谱；1st：一阶导数；msc：多元散射校正；nd平滑：norrisderivativefiter；sg平滑：savitzky-golayfilter；主成分因子数均为各预处理方式下匹配的最优参数条件。

通过各种光谱预处理方法对谱图进行优化，分析软件自动选择波数范围和主成分数，结果由相关系数r和均方根误差(rmsec和rmsep)来评价模型的优劣，r(rp大于阈值0.7)越大，rmsec和rmsep越小，相对分析误差(rpd)越大，则该预处理方法较好。判断模型是否适用于实际检验，相对分析误差(rpd)是重要的指标：rpd是标准差与均方根误差的比值，用于证明模型的预测能力。rpd数值差异较小，0.1之差可能是因为所收集的样品分布和范围差异的代表性较差，也可能因为模型数据处理方式选择不佳，导致参考值和预测值的线性拟合较差，均方根误差较大，0.1之差表示了完全不同的准确性结果；当rpd≥3时，说明效果良好，所建模型可以用于实际检测；如果rpd<3，说明检测欠佳，精度有待于提高。

具体结果如表2所示，油酸、亚油酸和α-亚麻酸的最佳预处理方法分别为msc+sg、msc+sg+1st、msc+sg，pls建模中r分别为0.9215、0.7424和0.8969，rmsec分别为0.08、0.19和0.77，rmsep分别为0.15、0.24和0.77，rpd分别为2.9、1.8和3.9，油酸和α-亚麻酸的预处理方法较好，r值均达到0.85以上，模型具有较好的预测精确度，可用于实际样品的定量测定，而亚油酸大于0.75，小于0.8，rpd为2，模型相比另外两种稍稍欠佳，但仍可用于亚油酸的粗测。

实施例4：不同预处理波段对奇亚籽不饱和脂肪酸含量pls建模影响

参考实施例1，油酸、亚油酸和α-亚麻酸分别选用最佳预处理方式为msc+sg、msc+sg+1st、msc+sg，以油酸为例，将步骤(2)中的波段替换为如表3所示的波数范围，其他条件不变，进行pls建模。

表3选用不同波段范围下奇亚籽不饱和脂肪酸含量的pls建模结果

选用4000-10000cm^-1全波数区间建立偏最小二乘法建立校正模型，得到预测值与实际油酸含量值的线性模型；pls建模中r为0.9215，rpd为2.9，rpd<3，表明全波数下模型准确性欠佳，但仍可以用于油酸含量的粗测。综合考虑表2和表3，特定波数4000-4800、8000-8800、9000-10000cm^-1下，r为0.9447，rmsec和rmsep分别为0.10、0.13，rpd为3.4，说明在特定波数下模型具有更高的预测精确度，更有助于实际样品的准确定量测定。亚油酸特定波数4000-6000和6500-7400cm^-1下，r为0.7576，rmsec和rmsep均为0.23，rpd为2.0。α-亚麻酸特定波数4000-4300、4800-6000和6800-9000cm^-1下，r为0.9043，rmsec和rmsep分别为0.76、0.75，rpd为4。

此外，在使用pls建模时，主成分数也是校正模型的评价参数之一，当均方根误差(rmsecv)随着主成分数的增加而减少直至几乎稳定时，得到油酸、亚油酸和α-亚麻酸模型的最佳主成分数分别为13、4和9(见图3)，此时贡献率均达93％以上。