蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法与流程

本申请涉及饲料质量安全检测领域，具体而言，涉及一种蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法。

背景技术：

蛋白饲料原料(豆粕、棉粕、菜籽粕)是重要的饲料蛋白源，被大量应用于畜禽养殖。土霉素药渣是生物发酵生产土霉素后剩余的发酵培养基经过滤后产生废渣，具有一定粗蛋白。曾有媒体报道，不法养殖者掺加土霉素药渣到饲料蛋白原料中替代使用。由于养殖过程使用含有土霉素药渣的饲料原料具有危害养殖动物健康、影响食品安全和诱导产生细菌耐药性等潜在风险隐患，我国农业部、卫生部和国家药品监督管理局联合发布的第176号公告明确规定禁止将土霉素药渣掺加到饲料中使用。

目前，国内外已有的检测技术虽然能够准确测定饲料蛋白原料中土霉素含量，但无法鉴别是由于添加土霉素原型药还是掺加土霉素药渣所造成的。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本申请提供一种蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法，以改善现有的鉴别方法，无法区别饲料蛋白原料中土霉素是由于添加土霉素原型药还是掺加土霉素药渣所造成的问题。

根据本申请实施例提供的蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法，其包括：

将蛋白饲料原料经第一溶剂提取，用第二溶剂稀释，过滤，获得待测液。

以土霉素、四环素和脱水四环素作为土霉素药渣的标志物，将待测液经液相色谱分离，质谱检测，鉴别蛋白饲料原料是否存在标志物。

其中，第一溶剂为有机溶剂。

根据本申请实施例的蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法，以土霉素、四环素和脱水四环素作为土霉素药渣的标志物，通过液相色谱-质谱联用法，有效获得蛋白饲料原料是否含有标志物，若含有标志物，则代表蛋白饲料原料掺加有土霉素药渣，若不含有标志物，或含有的标志物只有其中一种或两种，则代表没有掺加有土霉素药渣。

采用上述鉴别方法能够有效鉴别蛋白饲料原料是否含有土霉素，且能够有效区分该土霉素是由于添加土霉素原型药还是掺加土霉素药渣所造成的，也即是，有效鉴别蛋白饲料原料是否掺加土霉素药渣。

另外，根据本申请实施例的蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法还具有如下附加的技术特征：

本申请示出的一些实施例中，质谱检测中，以质荷比为461.1555m/z作为土霉素的特征碎片，以质荷比为445.1606m/z作为四环素的特征碎片，以质荷比为443.1450m/z作为脱水四环素的特征碎片。

换言之，质谱检测的步骤中，在得到的质谱图中，确认上述特征碎片是否存在，以鉴别蛋白饲料原料是否存在标志物。

本申请示出的一些实施例中，将待测液经液相色谱分离的步骤包括：

以流动相a和流动相b进行梯度洗脱。

其中，流动相a为1.5mm～2.5mm醋酸氨水溶液，醋酸氨水溶液中含有体积浓度为0.15％～0.25％的甲酸。

流动相b为乙腈。

本申请示出的一些实施例中，梯度洗脱的步骤中，以体积百分比计，按照以下方式进行：

0～0.5min时，流动相a保持为95％，流动相b保持为5％。

0.5～3.0min时，流动相a由95％减小至85％，流动相b由5％增加至15％。

3.0～10.0min时，流动相a由85％减小至60％，流动相b由15％增加至40％。

10.0～18.0min时，流动相a由60％减小至0，流动相b由40％增加至100％。

18.0～23.0min时，流动相a保持为0，流动相b保持为100％。

23.0～25.0min时，流动相a保持为95％，流动相b保持为5％。

可选地，梯度洗脱的流速为0.3～0.5ml/min。

可选地，液相色谱分离的步骤中，所用的色谱柱的固定相为十八烷基官能团。

可选地，色谱柱为zorbaxeclipseplusc18色谱柱。

可选地，色谱柱的柱温为38℃～42℃。

本申请示出的一些实施例中，质谱检测包括：采用四级杆飞行时间质谱对经液相色谱分离后的产物进行检测。

可选地，质谱检测的条件为：

电喷雾电离源；正离子扫描，扫描范围400-500m/z；干燥气温度：250℃；干燥气流量：7l/min；雾化气压力：7psi；鞘气温度：325℃；鞘气流量：11l/min；喷嘴电压200v；毛细管电压：3kv；毛细管出口电压：120v；skimmer电压750v。

本申请示出的一些实施例中，第二溶剂包括浓度为1.5mm～2.5mm的醋酸氨水溶液，醋酸氨水溶液中含有体积浓度为0.15％～0.25％的甲酸。

通过上述第二溶剂的稀释，降低质谱分析中的基质效应。

本申请示出的一些实施例中，蛋白饲料原料的粒径≥18目。

可选地，蛋白饲料原料的粒径为18～40目。

上述条件下，有效增大蛋白饲料原料与第一溶剂的接触面，提取效果佳。

本申请示出的一些实施例中，第一溶剂包括甲醇。

甲醇能够有效渗入蛋白饲料原料，提取效果佳。

本申请示出的一些实施例中，将蛋白饲料原料经第一溶剂提取的步骤包括：

将蛋白饲料原料与第一溶剂按照1g：(8ml～12ml)混合，振荡提取，获得提取液。

将提取液离心后取上清液。

可选地，将提取液以5000r/min～7000r/min的速率离心4min～6min。

可选地，蛋白饲料原料包括菜籽粕、豆粕和棉粕中的至少一种。

本申请实施例提供的蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法的有益效果是：样品用量少，前处理过程简单，检测时间短、灵敏度较高，结果准确。同时以土霉素、四环素和脱水四环素作为土霉素药渣的标志物，通过液相色谱-质谱联用法，能够有效鉴别蛋白饲料原料是否含有土霉素，且能够有效区分该土霉素是由于添加土霉素原型药还是掺加土霉素药渣所造成的，也即是，有效鉴别蛋白饲料原料是否掺加土霉素药渣。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本申请实施例1中土霉素特征碎片提取色谱图；

图2为本申请实施例1中四环素特征碎片提取色谱图；

图3为本申请实施例1中脱水四环素特征碎片提取色谱图；

图4为本申请实施例1中土霉素特征碎片离子图；

图5为本申请实施例1中四环素特征碎片离子图；

图6为本申请实施例1中脱水四环素特征碎片离子图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本申请中，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

下面对本申请实施例的蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法进行具体说明。

其中，本申请提供的蛋白饲料原料包括但不局限于菜籽粕、豆粕和棉粕中的至少一种。例如，蛋白饲料原料为菜籽粕，其为其是以油菜籽为原料经过取油后的副产物，其蛋白质含量在34％～38％之间，氨基酸组成中蛋氨酸和赖氨酸比例较高，属于我国三大蛋白原料(豆粕、棉粕、菜籽粕)之一，是重要的饲料蛋白源，其中，需要说明的是，蛋白饲料原料，例如菜籽粕可以为直接压榨后的料渣，也可以为发酵后的料渣。

土霉素药渣是生物发酵生产土霉素后剩余的发酵培养基经过滤后产生废渣，与蛋白饲料原料混合后，无法有效进行分辨。

由于土霉素可以添加于蛋白饲料原料而土霉素药渣禁止添加，因此鉴别饲料蛋白原料中土霉素是由于添加土霉素原型药还是掺加土霉素药渣所造成的，对监管饲料蛋白原料的质量具有显著的意义。

土霉素药渣是生物发酵生产土霉素后剩余的发酵培养基经过滤后产生废渣，土霉素药渣除了含有终产物土霉素以外，还含有未被完全提取的药物残留和未经安全性评价的次级代谢产物，发明人从上述次级代谢产物、未被完全提取的药物残留中，经过大量的筛选、组合，确认以采用土霉素、四环素和脱水四环素共同作为土霉素药渣的标志物时，操作简单，能够有效鉴别饲料蛋白原料是否掺加有土霉素药渣。当标志物仅含有土霉素和四环素时，或标志物仅含有土霉素和脱水四环素时，经验证，无法合理的鉴别饲料蛋白原料是否掺加有土霉素药渣。

需要说明的是，此处采用土霉素、四环素和脱水四环素三者共同作为标志物，鉴别方式最为简单，在土霉素、四环素和脱水四环素的基础上添加其他的物质，共同作为标记物，也在本申请提供的保护范围内。

本申请提供的蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法，其包括：

s1.将蛋白饲料原料经第一溶剂提取，用第二溶剂稀释，过滤，获得待测液。

可选地，蛋白饲料原料的粒径≥18目，该粒径范围内的蛋白饲料原料的粒径小，可充分与第一溶剂接触，充分提取蛋白饲料原料中的相关物质，提高提取效率。

实际的鉴别操作过程中，申请人发现，由于蛋白饲料原料含有一定的湿度，在后续过滤时，由于蛋白饲料原料粒径过小，因此容易黏结，堵塞筛孔，后续无法有效进行过滤，因此进一步可选地，蛋白饲料原料的粒径为18～40目，例如蛋白饲料原料的粒径为18目、20目、24目、28目、30目、32目、35目、40目中的任一值或任意两个点值之间的范围值。

承上述，若蛋白饲料原料颗粒较大，可在经第一溶剂提取前进行粉碎、过筛，以满足上述粒径范围的要求。

其中，第一溶剂为有机溶剂，其能够有效提取蛋白饲料原料中的有效成分。可选地，第一溶剂包括甲醇，其中，甲醇渗透性佳，能够有效提取蛋白饲料原料中的有效成分。

可选地，本申请示出的一种示例中，将蛋白饲料原料经第一溶剂提取的步骤包括：

将蛋白饲料原料与第一溶剂按照1g：(8ml～12ml)混合，例如将蛋白饲料原料与第一溶剂按照1g：8ml、1g：9ml、1g：9.5ml、1g：10ml、1g：11ml、1g：12ml中的任一固液比值或任意两个固液比值之间的范围值进行混合，然后振荡提取，获得提取液；将提取液离心后取上清液。

其中，除了振荡提取的方式以外，还可以采用静置提取或搅拌提取，其中，振荡提取和搅拌提取的效率均高于静置提取，且相关物质的提取更为充分。

可选地，将提取液以5000r/min～7000r/min的速率离心4min～6min；可选地，将提取液以6000r/min的速率离心5min。通过上述操作，有效去除杂质，保证上清液中杂质含量低。

其中，第二溶剂包括但不局限于水。

本申请示出的一些实施例中，第二溶剂可以为浓度为1.5mm～2.5mm的醋酸氨水溶液，例如第二溶剂为浓度为1.5mm、1.7mm、2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm中的任一浓度值或任意两个浓度值之间的范围值的醋酸氨水溶液，其中，该醋酸氨水溶液中含0.15v/v％～0.25v/v％的甲酸，也即是说醋酸氨水溶液中，醋酸氨的浓度为1.5mm～2.5mm，同时醋酸氨水溶液中含有甲酸，甲酸在醋酸氨水溶液中的体积浓度为0.15％～0.25％。例如醋酸氨水溶液中含0.15v/v％、0.18v/v％、0.2v/v％、0.22v/v％、0.25v/v％中的任一体积浓度的甲酸或任意两个体积浓度值所限定的范围值的甲酸。通过上述第二溶剂的稀释，降低质谱分析中的基质效应。

其中，过滤可采用有机滤膜等过滤，其中有机滤膜例如为聚四氟乙烯滤膜等，有效净化稀释后的溶液，降低待测液中的杂质，防止颗粒物堵塞质谱分析系统管路。

s2.以土霉素、四环素和脱水四环素作为土霉素药渣的标志物，将待测液经液相色谱分离，质谱检测，鉴别蛋白饲料原料是否存在标志物。

换言之，以土霉素、四环素和脱水四环素作为土霉素药渣的标志物，通过液相色谱-质谱联用法，获得蛋白饲料原料是否含有标志物，若含有标志物，则代表蛋白饲料原料掺加有土霉素药渣，若不含有标志物，或含有的标志物只有其中一种或两种，则代表没有掺加有土霉素药渣。

其中，将待测液经液相色谱分离，质谱检测，可通过液相色谱质谱联用仪检测。

本申请示出的一些实施例中，将待测液经液相色谱分离的步骤包括：以流动相a和流动相b进行梯度洗脱。

其中，流动相a为1.5mm～2.5mm醋酸氨水溶液，醋酸氨水溶液中含0.15v/v％～0.25v/v％的甲酸；流动相b为乙腈。也即是说流动相a为醋酸氨水溶液中，醋酸氨的浓度为1.5mm～2.5mm，同时醋酸氨水溶液中含有甲酸，甲酸在醋酸氨水溶液中的体积浓度为0.15％～0.25％。

换言之，流动相a为浓度为1.5mm、1.7mm、2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm中的任一浓度值或任意两个浓度值之间的范围值的醋酸氨水溶液，其中，该醋酸氨水溶液中含0.15v/v％、0.18v/v％、0.2v/v％、0.22v/v％、0.25v/v％中的任一体积浓度的甲酸或任意两个体积浓度值所限定的范围值的甲酸。

承上述，为了使采用第二溶剂稀释后的待测液，进行液相色谱分离的效果更佳化，可选地，第二溶剂为流动相a，也即是说，第二溶剂与流动相a相同。

需注意的是，梯度洗脱过程中，以体积百分比计，流动相a+流动相b＝100％。

具体地，本申请示出的一些实施例中，梯度洗脱的步骤中，以体积百分比计，按照以下方式进行：

0～0.5min时，流动相a保持为95％，流动相b保持为5％。

0.5～3.0min时，流动相a由95％减小至85％，流动相b由5％增加至15％。

3.0～10.0min时，流动相a由85％减小至60％，流动相b由15％增加至40％。

10.0～18.0min时，流动相a由60％减小至0，流动相b由40％增加至100％。

18.0～23.0min时，流动相a保持为0，流动相b保持为100％。

23.0～25.0min时，流动相a保持为95％，流动相b保持为5％。

可选地，梯度洗脱的流速为0.3～0.5ml/min，例如梯度洗脱的流速为0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min中的任一流速值或介于任意两个流速值之间。需注意的是，本申请所涉及的介于，包括两个端点值。

可选地，液相色谱分离的步骤中，所用的色谱柱的固定相为十八烷基官能团。

可选地，色谱柱为zorbaxeclipseplusc18色谱柱。

可选地，色谱柱的柱温为38℃～42℃，例如柱温为38℃、39℃、40℃、41℃、42℃中的任一温度值或介于任意两个温度值之间。

本申请提供的实施例中，可选地，质谱检测包括：采用四级杆飞行时间质谱对经液相色谱分离后的产物进行检测。

四级杆飞行时间质谱例如为agilent6465lc-qtof四级杆飞行时间质谱。

可选地，质谱检测的条件为：

电喷雾电离源；正离子扫描，扫描范围400-500m/z；干燥气温度：250℃；干燥气流量：7l/min；雾化气压力：7psi；鞘气温度：325℃；鞘气流量：11l/min；喷嘴电压200v；毛细管电压：3kv；毛细管出口电压：120v；skimmer电压750v。

可选地，质谱检测中，以质荷比为461.1555m/z作为土霉素的特征碎片，以质荷比为445.1606m/z作为四环素的特征碎片，以质荷比为443.1450m/z作为脱水四环素的特征碎片。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法，其包括：

s1.将掺加土霉素药渣(10％，m/m)的菜籽粕采用旋风磨进行粉碎，粉碎后的粒度达到18目。

s2.称取0.5g步骤s1粉碎后的样品至洁净的离心管中，加入5ml甲醇，涡旋2分钟，置于摇床上振摇30分钟进行提取。提取完成后在6000r/min的离心力下离心5min，取上清液作为提取溶液。

s3.吸取0.5ml步骤s2中的提取溶液，加等体积的流动相a稀释，然后采用聚四氟乙烯滤膜过滤，得到净化后的待测液。

s4.吸取0.5ml步骤s3得到的待测液，进行液相色谱分离。液相色谱分离的条件如下：

①色谱柱为zorbaxeclipseplusc18色谱柱，柱温：42℃。

②流动相a为：2.0mm醋酸氨水溶液(含0.2v/v％甲酸)，流动相b为：乙腈。流速为0.5ml/min。

③采用梯度洗脱方式：以体积百分比计，0～0.5min时，流动相a保持为95％，流动相b保持为5％。

0.5～3.0min时，流动相a由95％减小至85％，流动相b由5％增加至15％。

3.0～10.0min时，流动相a由85％减小至60％，流动相b由15％增加至40％。

10.0～18.0min时，流动相a由60％减小至0，流动相b由40％增加至100％。

18.0～23.0min时，流动相a保持为0，流动相b保持为100％。

23.0～25.0min时，流动相a保持为95％，流动相b保持为5％。

④进样量：20ul。

s5.将经步骤s4液相色谱分离后的成分通过四级杆飞行时间质谱(agilent6465lc-qtof)检测，质谱条件如下：

电喷雾电离源；正离子扫描，扫描范围400-500m/z；干燥气温度：250℃；干燥气流量：7l/min；雾化气压力：7psi；鞘气温度：325℃；鞘气流量：11l/min；喷嘴电压200v；毛细管电压：3kv；毛细管出口电压：120v；skimmer电压750v。

s6.结果判定：

在液相色谱-质谱图中，通过特征碎片提取，在5.976min处提取出土霉素特征碎片提取色谱图如图1所示。在5.701min处提取出四环素特征碎片提取色谱图如图2所示。在7.994min处提取出脱水四环素特征碎片提取色谱图如图3所示。通过碎片离子分析，检测出土霉素特征碎片离子445.1606m/z如图4所示，检出四环素特征碎片离子461.1555m/z如图5所示，检出脱水四环素特征碎片离子443.1450m/z如图6所示。结果表明，菜籽粕中检出土霉素药渣标志物，说明含有土霉素药渣，该鉴别结果与实际情况相同。

实施例2

一种蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法，其包括：

s1.将掺加土霉素药渣(10％，m/m)的菜籽粕采用旋风磨进行粉碎，粉碎后的粒度达到20目。

s2.称取0.5g步骤s1粉碎后的样品至洁净的离心管中，加入4ml甲醇，涡旋2分钟，置于摇床上振摇30分钟进行提取。提取完成后在5000r/min离心力下离心6min，取上清液作为提取溶液。

s3.吸取步骤s2中的0.5ml的提取溶液，加等体积的流动相a稀释，采用聚四氟乙烯滤膜过滤，得到净化后的待测液。

s4.吸取0.5ml步骤s3得到的待测液，进行液相色谱分离。液相色谱分离的条件如下：

①色谱柱为zorbaxeclipseplusc18色谱柱，柱温：38℃。

②流动相a为：1.5mm醋酸氨水溶液(含0.15v/v％甲酸)，流动相b为：乙腈。流速为0.5ml/min。

③采用梯度洗脱方式：以体积百分比计，0～0.5min时，流动相a保持为95％，流动相b保持为5％。

0.5～3.0min时，流动相a由95％减小至85％，流动相b由5％增加至15％。

3.0～10.0min时，流动相a由85％减小至60％，流动相b由15％增加至40％。

10.0～18.0min时，流动相a由60％减小至0，流动相b由40％增加至100％。

18.0～23.0min时，流动相a保持为0，流动相b保持为100％。

23.0～25.0min时，流动相a保持为95％，流动相b保持为5％。

④进样量：20ul。

s5.将经步骤s4液相色谱分离后的成分通过四级杆飞行时间质谱(agilent6465lc-qtof)检测，质谱条件如下：

电喷雾电离源；正离子扫描，扫描范围400-500m/z；干燥气温度：250℃；干燥气流量：7l/min；雾化气压力：7psi；鞘气温度：325℃；鞘气流量：11l/min；喷嘴电压200v；毛细管电压：3kv；毛细管出口电压：120v；skimmer电压750v。

s6.结果判定：

在液相色谱-质谱图中，通过特征碎片提取，在5.976min处提取出土霉素特征碎片。在5.701min处提取出四环素特征碎片。在7.994min处提取出脱水四环素特征碎片。结果表明，菜籽粕中检出土霉素药渣标志物，说明含有土霉素药渣，该鉴别结果与实际情况相同。

实施例3

一种蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法，其包括：

s1.将掺加土霉素药渣(10％，m/m)的菜籽粕采用旋风磨进行粉碎，粉碎后的粒度达到40目。

s2.称取0.5g步骤s1粉碎后的样品至洁净的离心管中，加入6ml提取溶剂(提取溶剂为甲醇)，涡旋2分钟，置于摇床上振摇30分钟进行提取。提取完成后在5000r/min离心力下离心6min，取上清液作为提取溶液。

s3.吸取0.5ml步骤s2中的提取溶液，加等体积的流动相a稀释，采用聚四氟乙烯滤膜过滤，得到净化后的待测液。

s4.吸取0.5ml步骤s3得到的待测液，进行液相色谱分离。液相色谱分离的条件如下：

①色谱柱为zorbaxeclipseplusc18色谱柱，柱温：40℃。

②流动相a为：2.0mm醋酸氨水溶液(含0.2v/v％甲酸)，流动相b为：乙腈，流速为0.5ml/min。

③采用梯度洗脱方式：以体积百分比计，0～0.5min时，流动相a保持为95％，流动相b保持为5％。

0.5～3.0min时，流动相a由95％减小至85％，流动相b由5％增加至15％。

3.0～10.0min时，流动相a由85％减小至60％，流动相b由15％增加至40％。

10.0～18.0min时，流动相a由60％减小至0，流动相b由40％增加至100％。

18.0～23.0min时，流动相a保持为0，流动相b保持为100％。

23.0～25.0min时，流动相a保持为95％，流动相b保持为5％。

④进样量：20ul。

s5.将经步骤s4液相色谱分离后成分通过四级杆飞行时间质谱(agilent6465lc-qtof)检测，质谱条件如下：

电喷雾电离源；正离子扫描，扫描范围400-500m/z；干燥气温度：250℃；干燥气流量：7l/min；雾化气压力：7psi；鞘气温度：325℃；鞘气流量：11l/min；喷嘴电压200v；毛细管电压：3kv；毛细管出口电压：120v；skimmer电压750v。

s6.结果判定：

在液相色谱-质谱图中，通过特征碎片提取，在5.976min处提取出土霉素特征碎片。在5.701min处提取出四环素特征碎片。在7.994min处提取出脱水四环素特征碎片。结果表明，菜籽粕中检出土霉素药渣标志物，说明含有土霉素药渣，该鉴别结果与实际情况相同。

综上，本申请提供的蛋白饲料原料掺加土霉素药渣的鉴别方法，样品用量少，前处理过程简单，检测时间短、灵敏度较高，结果准确，能够有效鉴别蛋白饲料原料是否掺加土霉素药渣。

以上仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。