一种肌钙蛋白I检测试方法与流程

本发明涉及生物医药技术领域；具体地说，是涉及一种肌钙蛋白i检测试方法。

背景技术：

心肌肌钙蛋白(ctn)是存在于心肌肌原纤维中细肌丝上的收缩调节蛋白，主要调节心肌收缩过程中粗、细肌丝之间的相对滑行。ctn含三个亚单位：肌钙蛋白i(ctni)、肌钙蛋白t(ctnt)和肌钙蛋白c(ctnc)。心肌钙蛋白i(ctni)是一个分子量为22.5kd的心肌蛋白，它与肌钙蛋白t(tnt)、肌钙蛋白c(tnc)一起形成一个心肌钙蛋白复合物，共同完成细胞内肌动蛋白间相互作用的钙信号传递的基本功能。

目前现有技术中，肌钙蛋白i的检测方法包括酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫分析试纸条检测、管式化学发光法等。肌钙蛋白i测定对灵敏度要求极高，目前化学发光法测试灵敏度最高，可实现0.03ng/ml的功能灵敏度检测能力，达到超敏检出级别。

但是0.03ng/ml目前处于市面上化学发光诊断试剂的检出极限，无论是试剂及仪器的波动，产品的性能就会出现对0.03ng/ml浓度附近样本检测的不准确性。提升肌钙蛋白i是所有医疗诊断行业的目标。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述传统技术的不足之处，提供一种肌钙蛋白i检测试方法，可实现0.01ng/ml功能灵敏度的测定。

本发明的目的是通过以下技术措施来达到的：

一种肌钙蛋白i检测试方法，包括以下步骤：

s1、fc结合蛋白进行吖啶酯标记：

s2、ctni单抗进行吖啶酯标记；

s3、fc结合蛋白与ctni单抗反应；

s4、分离未结合的bsa。

作为一种改进：所述步骤s1，包括以下步骤：

a1、取fc结合蛋白溶解于mes溶液中，充分溶解，配置成0.5-2.0mg/ml的bsa溶液；

a2、向a1的产物中加入偶联剂edc溶液；

a3、向a2的产物中加入吖啶酯溶液；

a4、向a3的产物中加入甘氨酸溶液；

a5、对a4的产物进行超滤，除去未结合的过量的吖啶酯。

作为一种改进：在步骤a1中，所述fc结合蛋白的质量为0.5-2.0mg，所述mes溶液的体积为1ml；

在步骤a2中，所述fc结合蛋白溶液的体积为1ml，所述偶联剂edc的浓度为10-50mg/ml，所述偶联剂edc的体积为50-100ul，于25-37℃温度下，反应0.5-1h；

在步骤a3中，所述吖啶酯溶液的浓度为0.5-2.0mg/ml，所述吖啶酯溶液的体积为50ul，于25-37℃温度下，反应0.5-1h。

在步骤a4中，所述甘氨酸溶液的浓度为5.0-10mg/ml，所述甘氨酸溶液的体积为1ml，于25-37℃温度下，反应20-30min。

在步骤a5中，使用10-30kd超滤管，转速6000-8000rpm，时间15-30min。

作为一种改进：所述步骤s2，包括以下步骤：

b1、取ctni单抗溶解于mes溶液中，充分溶解，配置成0.5-1mg/ml的bsa溶液；

b2、向b1的产物中加入偶联剂edc溶液；

b3、向b2的产物中加入吖啶酯溶液；

b4、向b3的产物中加入甘氨酸溶液；

b5、对b4的产物进行超滤，除去未结合的过量的吖啶酯。

作为一种改进：在步骤b1中，所述ctni单抗的质量为0.5-1mg，所述mes溶液的体积为1ml；

在步骤b2中，所述ctni单抗溶液的体积为1ml，所述偶联剂edc的浓度为10-50mg/ml，所述偶联剂edc的体积为50-100ul，于25-37℃温度下，反应0.5-1h；

在步骤b3中，所述吖啶酯溶液的浓度为0.5-1mg/ml，所述吖啶酯溶液的体积为50ul，于25-37℃温度下，反应0.5-1h。

在步骤b4中，所述甘氨酸溶液的浓度为5.0-10mg/ml，所述甘氨酸溶液的体积为1ml，于25-37℃温度下，反应20-30min。

在步骤b5中，使用10-30kd超滤管，转速6000-8000rpm，时间15-30min。

作为一种改进：所述步骤s3，包括以下步骤：

c1、将吖啶酯标记的ctni单抗和吖啶酯标记的fc结合蛋白进行混合、反应。

作为一种改进：在步骤c1中，吖啶酯标记的ctni单抗和吖啶酯标记的fc结合蛋白的摩尔比为1:1~1:5，于25-37℃温度下，反应20-30min。

作为一种改进：所述步骤s4，包括以下步骤：

d1、使用分子筛层析法，分离纯化ctni-fc结合蛋白复合物。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明的优点是：吖啶酯属于闪光型标记物，与激发液混合后，能够瞬时达到一个极高的发光值，将吖啶酯标记物标记在ctni单抗上和fc结合蛋白上，通过单抗上的fc区域与fc结合蛋白反应，形成一个ctni单抗-fc结合蛋白复合物，该复合物将有更多的吖啶酯载量，能够瞬时激发出更高信号的发光值，实现0.01ng/ml功能灵敏度的测定。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

附图1是本发明技术方案检测结果对照示意图。

附图2是本发明技术方案cv情况对照示意图。

具体实施方式

实施例1：一种肌钙蛋白i检测试方法，包括以下步骤。

s1、fc结合蛋白进行吖啶酯标记。

所述步骤s1，包括以下步骤：

a1、取0.5mgfc结合蛋白溶解于1mlmes溶液中，充分溶解，配置成0.5mg/ml的bsa溶液；

a2、向1mla1的产物中加入浓度为10mg/ml的偶联剂edc溶液50ul，于25℃温度下，反应0.5h；

a3、向a2的产物中加入浓度为0.5mg/ml的吖啶酯溶液50ul，于25℃温度下，反应0.5h；

a4、向a3的产物中加入浓度为5.0mg/ml的甘氨酸溶液1ml，于25℃温度下，反应20min；

a5、使用10kd超滤管对a4的产物进行超滤，转速6000rpm，时间15min，除去未结合的过量的吖啶酯。

s2、ctni单抗进行吖啶酯标记，包括以下步骤。

所述步骤s2，包括以下步骤：

b1、取0.5mgctni单抗溶解于1mlmes溶液中，充分溶解，配置成0.5mg/ml的bsa溶液；

b2、向1mlb1的产物中加入浓度为10mg/ml的偶联剂edc溶液50ul，于25℃温度下，反应0.5h；

b3、向b2的产物中加入浓度为0.5mg/ml的吖啶酯溶液50ul，于25℃温度下，反应0.5h；

b4、向b3的产物中加入浓度为5.0mg/ml的甘氨酸溶液1ml，于25℃温度下，反应20min；

b5、使用10kd超滤管，对b4的产物进行超滤，转速6000rpm，时间15min，除去未结合的过量的吖啶酯。

s3、fc结合蛋白与ctni单抗反应，包括以下步骤：

所述步骤s3，包括以下步骤：

c1、将吖啶酯标记的ctni单抗和吖啶酯标记的fc结合蛋白按摩尔比为1:1进行混合，于25℃温度下，反应20min。

s4、分离未结合的bsa，包括以下步骤。

所述步骤s4，包括以下步骤：

d1、使用分子筛层析法，分离纯化ctni-fc结合蛋白复合物。

实施例2：一种肌钙蛋白i检测试方法，包括以下步骤。

s1、fc结合蛋白进行吖啶酯标记。

所述步骤s1，包括以下步骤：

a1、取1.0mgfc结合蛋白溶解于1mlmes溶液中，充分溶解，配置成1.0mg/ml的bsa溶液；

a2、向1mla1的产物中加入浓度为25mg/ml的偶联剂edc溶液65ul，于29℃温度下，反应0.65h；

a3、向a2的产物中加入浓度为1.0mg/ml的吖啶酯溶液50ul，于29℃温度下，反应0.65h；

a4、向a3的产物中加入浓度为6.5mg/ml的甘氨酸溶液1ml，于29℃温度下，反应23min；

a5、使用20kd超滤管对a4的产物进行超滤，转速7000rpm，时间16.5min，除去未结合的过量的吖啶酯。

s2、ctni单抗进行吖啶酯标记，包括以下步骤。

所述步骤s2，包括以下步骤：

b1、取0.65mgctni单抗溶解于1mlmes溶液中，充分溶解，配置成0.65mg/ml的bsa溶液；

b2、向1mlb1的产物中加入浓度为25mg/ml的偶联剂edc溶液65ul，于29℃温度下，反应0.65h；

b3、向b2的产物中加入浓度为0.65mg/ml的吖啶酯溶液50ul，于29℃温度下，反应0.65h；

b4、向b3的产物中加入浓度为6.5mg/ml的甘氨酸溶液1ml，于29℃温度下，反应23min；

b5、使用20kd超滤管，对b4的产物进行超滤，转速7000rpm，时间20min，除去未结合的过量的吖啶酯。

s3、fc结合蛋白与ctni单抗反应，包括以下步骤：

所述步骤s3，包括以下步骤：

c1、将吖啶酯标记的ctni单抗和吖啶酯标记的fc结合蛋白按摩尔比为1:1~1:5进行混合，于29℃温度下，反应23min。

s4、分离未结合的bsa，包括以下步骤。

所述步骤s4，包括以下步骤：

d1、使用分子筛层析法，分离纯化ctni-fc结合蛋白复合物。

实施例3：一种肌钙蛋白i检测试方法，包括以下步骤。

s1、fc结合蛋白进行吖啶酯标记。

所述步骤s1，包括以下步骤：

a1、取1.5mgfc结合蛋白溶解于1mlmes溶液中，充分溶解，配置成1.5mg/ml的bsa溶液；

a2、向1mla1的产物中加入浓度为40mg/ml的偶联剂edc溶液80ul，于33℃温度下，反应0.8h；

a3、向a2的产物中加入浓度为1.5mg/ml的吖啶酯溶液50ul，于33℃温度下，反应0.8h；

a4、向a3的产物中加入浓度为8mg/ml的甘氨酸溶液1ml，于33℃温度下，反应26min；

a5、使用20kd超滤管对a4的产物进行超滤，转速7000rpm，时间25min，除去未结合的过量的吖啶酯。

s2、ctni单抗进行吖啶酯标记，包括以下步骤。

所述步骤s2，包括以下步骤：

b1、取0.8mgctni单抗溶解于1mlmes溶液中，充分溶解，配置成0.8mg/ml的bsa溶液；

b2、向1mlb1的产物中加入浓度为40mg/ml的偶联剂edc溶液80ul，于33℃温度下，反应0.8h；

b3、向b2的产物中加入浓度为0.8mg/ml的吖啶酯溶液50ul，于33℃温度下，反应0.8h；

b4、向b3的产物中加入浓度为8mg/ml的甘氨酸溶液1ml，于33℃温度下，反应26min；

b5、使用20kd超滤管，对b4的产物进行超滤，转速7000rpm，时间25min，除去未结合的过量的吖啶酯。

s3、fc结合蛋白与ctni单抗反应，包括以下步骤：

所述步骤s3，包括以下步骤：

c1、将吖啶酯标记的ctni单抗和吖啶酯标记的fc结合蛋白按摩尔比为1:3进行混合，于33℃温度下，反应26min。

s4、分离未结合的bsa，包括以下步骤。

所述步骤s4，包括以下步骤：

d1、使用分子筛层析法，分离纯化ctni-fc结合蛋白复合物。

实施例4：一种肌钙蛋白i检测试方法，包括以下步骤。

s1、fc结合蛋白进行吖啶酯标记。

所述步骤s1，包括以下步骤：

a1、取2.0mgfc结合蛋白溶解于1mlmes溶液中，充分溶解，配置成2.0mg/ml的bsa溶液；

a2、向1mla1的产物中加入浓度为50mg/ml的偶联剂edc溶液100ul，于37℃温度下，反应1h；

a3、向a2的产物中加入浓度为2.0mg/ml的吖啶酯溶液50ul，于37℃温度下，反应1h；

a4、向a3的产物中加入浓度为10mg/ml的甘氨酸溶液1ml，于37℃温度下，反应30min；

a5、使用30kd超滤管对a4的产物进行超滤，转速8000rpm，时间30min，除去未结合的过量的吖啶酯。

s2、ctni单抗进行吖啶酯标记，包括以下步骤。

所述步骤s2，包括以下步骤：

b1、取1mgctni单抗溶解于1mlmes溶液中，充分溶解，配置成1mg/ml的bsa溶液；

b2、向1mlb1的产物中加入浓度为50mg/ml的偶联剂edc溶液100ul，于37℃温度下，反应1h；

b3、向b2的产物中加入浓度为1mg/ml的吖啶酯溶液50ul，于37℃温度下，反应1h；

b4、向b3的产物中加入浓度为10mg/ml的甘氨酸溶液1ml，于37℃温度下，反应30min；

b5、使用30kd超滤管，对b4的产物进行超滤，转速8000rpm，时间30min，除去未结合的过量的吖啶酯。

s3、fc结合蛋白与ctni单抗反应，包括以下步骤：

所述步骤s3，包括以下步骤：

c1、将吖啶酯标记的ctni单抗和吖啶酯标记的fc结合蛋白按摩尔比为1:5进行混合，于37℃温度下，反应30min。

s4、分离未结合的bsa，包括以下步骤。

所述步骤s4，包括以下步骤：

d1、使用分子筛层析法，分离纯化ctni-fc结合蛋白复合物。

如图1所示，对照试剂为目前市场上肌钙蛋白i检测灵敏度最高的产品，雅培超敏肌钙蛋白i测定试剂盒。实施1-4为使用本发明专利技术对吖啶酯标记物进行改造的试剂。对照组对20例临床心肌损伤病例检查结果中有8例样本检测结果为0，而实施例对20例临床心肌损伤病例样本检测结果均能检测出结果。

如图2所示，功能灵敏度是能够准确进行定量检测的下限，一般认为在测量较低浓度样本时，重复测试20次，cv<20%的最低浓度点。下表为对照试剂和实施例同时测试0.03ng/ml浓度样本20次的cv情况，0.03ng/ml是对照试剂宣称的最低浓度点。由数据可以看出，实施例在该浓度时，cv只有6%,说明实施例分析灵敏度浓度值要低于0.03ng/ml,灵敏度高于对照试剂。

以上对本发明的数个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。