余甘子鞣质部位及口服余甘子鞣质部位后血清中化学成分分析检测方法与流程

本发明涉及一种余甘子鞣质部位及口服后血清中化学成分uplc-msⁿ分析检测方法。

背景技术：

通常情况下，药物活性成分需要吸收入血、到达靶器官并作用于相应靶点后才能发挥药效。药效成分可能是经消化道吸收原型入血的成分，也可能是经代谢转化成的活性代谢产物，这些成分构成了发挥药效作用的物质基础，其在体内的动态变化反映了发挥药效作用的过程。研究药物的代谢可以为其药效物质基础研究提供理论基础，对于设计合理给药途径、给药剂量和指导临床应用有重要意义。

余甘子为大戟科余甘子属植物余甘子phyllanthusemblical.的干燥果实，是一种常用藏药，其富含鞣质，具有多种药理活性。目前，尚未发现口服余甘子鞣质部位后血清中化学成分分析检测报道。此外，由于代谢产物的量很少，分离鉴定代谢产物尤其同时分离鉴定多种代谢产物是具有挑战的工作。因此，需要一种能够有效分离鉴定口服余甘子鞣质部位后血清中化学成分的分析检测方法。

技术实现要素：

发明目的：本发明提供一种余甘子鞣质部位及口服后血清中化学成分uplc-msⁿ分析检测方法，其具有快速、简便、灵敏、可同时分离鉴定众多成分等优点。

技术方案：

本发明提供了一种余甘子鞣质部位及口服后血清中化学成分uplc-msⁿ分析检测方法，包括：余甘子鞣质部位供试液制备或口服余甘子部位后血清样品预处理；进样检测，收集数据，解析确认；其中色谱条件为色谱柱为c18色谱柱；和/或柱温28-32℃；和/或流速：0.1-0.5ml·min^-1；和/或检测波长：268-272nm；和/或流动相：甲醇-0.2%冰醋酸/水梯度洗脱；质谱条件：ms，esi：负离子模式；雾化气流：1.3-1.7l/min；离子源温度：280-320℃；干燥气压力：80-120kpa；质量扫描范围：m/z100～1500。

优选的，余甘子鞣质部位供试液制备：精密称取余甘子鞣质部位粉末加入溶剂溶解定容，进样前微孔滤膜过滤。优选的，浓度为0.1-1mg.ml^-1；溶剂为30-80%甲醇水溶液。

优选的，血清样品预处理：精密量取血清样品加入内标溶液、缓冲液，混合均匀，加入有机溶剂混合，离心，取上清液吹干，残渣加入有机溶剂水溶液溶解，离心，取上清液备用。

优选的，有机溶剂为甲醇或乙腈；有机溶剂水溶液为30-80%甲醇或乙腈水溶液；和/或混合方式为涡旋；和/或缓冲液为0.5-3mol.l^-1磷酸-磷酸二氢钾缓冲溶液；和/或离心转数为10000-30000r.min^-1；和/或使用惰性气体吹干。

优选的，色谱条件为：色谱柱：acquityuplcbehc18；和/或柱温：30℃；和/或流速：0.3ml.min^-1；和/或检测波长：270nm；和/或流动相：甲醇-0.2%冰醋酸水，流动相梯度为：0-5min5-15%甲醇，5-8min15-25%甲醇，8-10min25-30%甲醇，10-18min30-60%甲醇，18-26min60-90%甲醇，26-30min90-90%甲醇；30-30.1min90-5%甲醇；30.1-34min5-5%甲醇。

优选的，质谱条件为：esi：负离子模式；雾化气流：1.5l/min；离子源温度：300℃；干燥气压力：100kpa；质量扫描范围：m/z100～1500。

优选的，为小鼠灌胃。

优选的，在上述检测条件下余甘子鞣质部位中检测出126个成分。

优选的，正常小鼠灌胃余甘子鞣质部位后血清的化学成分共鉴定出150个化合物，其中原型成分67个，代谢成分有83个。

有益效果：首次建立了基于uplc-msⁿ法对余甘子鞣质部位及口服后血清中化学成分进行分离鉴定的方法，具有快速、简便、灵敏、可同时分离鉴定数量多等优点。能够有效评价口服余甘子鞣质部位后血清中代谢情况的分析方法。

附图说明：

图1余甘子鞣质部位总离子流图；

图2-23化合物离子碎片图；

图24混合对照品液质总离子流图；

图25正常小鼠口服余甘子鞣质部位后血清uplc-msⁿ。

具体实施方式

以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1.仪器与试药

thermo液相色谱-质谱联用仪（ltq-orbitrapxluplc-ms，thermofisher公司）；thermofoundation2.0分析软件（thermofisher公司）；微孔滤膜（津腾）；注射器（国药集团）；离心管（北京汇海科仪有限责任公司）；移液枪（eppendorfresearchplus）；枪头（北京汇海科仪有限公司）；十万分之一电子分析天平：sartoriousbt25s型（北京赛多利斯仪器有限公司）；万分之一天平：ohaus型号：ax124zh（奥豪斯仪器常州有限公司）；超声波清洗器（功率：100w，型号：kq-500de昆山超声仪器有限公司）；称量纸（洛阳北方玻璃技术股份有限公司）；棕色进样瓶（thermoscientific，北京汇海科仪科技有限公司）。

试剂：甲醇（fisher，质谱纯，北京汇海科仪科技有限公司）；蒸馏水（屈臣氏）；醋酸（fisherscientific，色谱纯，北京汇海科仪科技有限公司），其他试剂均为分析纯。

2.余甘子鞣质部位uplc-msⁿ分析检测方法与结果

2.1uplc-msⁿ条件

2.1.1色谱条件

色谱柱：acquityuplcbehc18column（2.1×100mm，1.7μm；partno:1860023452;serialno:0246325825758）柱温：30℃；流动相：甲醇-0.2%冰醋酸水；流速：0.3ml.min^-1；流动相梯度如表1。

表1流动相梯度表

2.1.2质谱条件

thermo液相色谱-质谱联用仪，ltq-orbitrapxlhplc-ms，esi：负离子模式；雾化气流：1.5l/min；离子源温度：300℃；干燥气压力：100kpa；质量扫描范围：m/z100～1500。

2.2供试液的制备

鞣质部位供试液制备：取余甘子鞣质部位粉末约25.00mg，精密称定，置于50ml棕色容量瓶中，加入一定量50%甲醇水溶液溶解然后稀释至刻度线，摇匀，备用，进样前经0.22μm微孔滤膜过滤，浓度为0.50mg.ml^-1。

2.3结果

2.3.1余甘子鞣质部位化学成分分析

将供试品溶液放入自动进样器中，进样和检测，记录总离子流图，见图1。余甘子鞣质部位化学成分分析见表2。液相色谱图中显示出了126个明显色谱峰，其中有鞣质类成分45个，小分子酚酸及其糖苷类19个，黄酮及其糖苷类成分24个，黏酸及其脂类21个，脂肪酸类15个，五环三萜类化合物2个。

表2余甘子鞣质部位化学成分分析

余甘子鞣质部位中化学成分离子碎片如图2-23所示。我们建立了鞣质部位的uplc-msⁿ研究方法，考察了余甘子鞣质部位在正离子和负离子两种模式下的总离子流图，结果发现其他条件相同时，余甘子鞣质部位在负离子模式下响应强度要明显增大，检测到的色谱峰要明显增多，因此本实验选择负离子模式下检测余甘子样品。在上述检测条件下余甘子鞣质部位中检测出126个成分，其中有鞣质类成分45个，小分子酚酸及其糖苷类19个，黄酮及其糖苷类成分24个，黏酸及其脂类21个，脂肪酸类15个。

3.余甘子鞣质部位在正常小鼠体内代谢的uplc-msⁿ研究方法与结果

3.1uplc-msⁿ条件

同节2.1项下。

3.2血清样品的制备

体重(30±2)g的健康雄性icr小鼠，随机分成6个组，每组12只，给药前禁食18h，自由饮水。按照0.1g/10g体重，分别灌胃给药，6组受试小鼠分别于给药后0、5、10、20、30、60、120、240、300、480、720min后腹主动脉取血，静置半小时以后离心，取上清液即得血清，将血清在-20℃冰箱保存直至分析。

3.3血清样品预处理

精密量取正常小鼠血清样品300μl，置具塞离心管中（5ml），依次加入20μl内标溶液，10μl磷酸-磷酸二氢钾缓冲液（1mol.l^-1），涡旋混溶1min。再加入1500μl色谱甲醇，涡旋混溶3min。然后放置于4℃离心机（13000r.min^-1）离心10min，取上清液。上清液40℃氮气吹干。残渣加入50%甲醇水溶液150μl，3min涡旋溶解。然后放置于4℃离心机（13000r.min^-1）离心10min，取上清液备用。

3.4样品测定

取供试品溶液适量，转移至棕色的样品瓶中，放入自动进样器，进样和检测，记录液相色谱图和总离子流图。

3.5结果

3.5.1混合对照品

混合对照品液质总离子流图如图24所示。a为没食子酸、b为安石榴苷a、c为安石榴苷b、d/e为没食子酸甲酯、老鹳草素、f为柯里拉京、g/h为诃黎勒酸、诃子林鞣酸、i为鞣花酸。

3.5.2正常小鼠口服余甘子鞣质部位

正常小鼠口服余甘子鞣质部位以后，血清样本液质总离子流图如图25所示。正常小鼠口服余甘子鞣质部位后血清化学成分分析见表3。

表3正常小鼠口服余甘子鞣质部位后血清化学成分分析

色谱峰解析

通过使用uplcltq-orbitrap仪器进行数据采集，结合诊断离子与中性丢失过滤等质谱鉴定方法，对正常小鼠灌胃余甘子鞣质部位后血清的化学成分进行研究。针对化合物不同的结构类型及不同的质谱裂解规律，选用了不同的数据挖掘方法，通过数据分析，共鉴定出150个化合物，其中原型成分67个，代谢成分有83个。

为了系统的研究余甘子鞣质部位在正常小鼠体内主要的代谢产物，我们利用uplc-msn方法，对icr小鼠灌胃给药余甘子鞣质部位后，余甘子鞣质部位中的各类化学成分在小鼠体内的代谢产物进行分析，比较并确认原型成分和代谢成分。为了保证能够得到全面的代谢产物，本章采用对icr小鼠灌胃给药余甘子鞣质部位后，不同时间点分别取血，将各个时间的血清分别按照“血清样品预处理方法”处理以后，进行合并，尽量保证能检测到所有的成分。对比分析含药血清和空白血清总离子流图，除去血清中内源性成分干扰，检测药源性化学成分。代谢物的鉴定是根据已发表文献、得到的高精度的质谱数据以及药物代谢基本规律完成的。

药物的代谢特点与化合物的结构有直接的关系。由余甘子鞣质部位中各类化合物基本结构可知，含有苯环的基本骨架，主要含有的官能团为-co-,-oh,-ch3,-cooh,-ch2oh,-och3。具有芳香结构容易发生羟基化；甲基、羟甲基易被氧化为羧基或醛基；羰基易被加氢还原；此外，含有甲基、羟基和羧基的化合物易发生脱甲基、脱羟基和脱羧反应；具有酯及缩醛结构的化合物易被水解成基本母核[m-h]^-；而羟基易与甲基、葡萄糖醛酸和硫酸发生结合反应。通过使用uplcltq-orbitrap仪器进行数据采集，结合诊断离子与中性丢失过滤等质谱鉴定方法，对正常小鼠灌胃余甘子鞣质部位后血清的化学成分进行研究。针对化合物不同的结构类型及不同的质谱裂解规律，选用了不同的数据挖掘方法，通过数据分析，共鉴定出150个化合物，其中原型成分67个，共分为5类，其中鞣质类化合物26个：黄酮及其糖苷类10个。黏酸类化合物9个。脂肪酸类9个。还有一个五环三萜类化合物：oleanicacid。代谢成分有83个，鞣质类代谢产物有14个，酚酸类代谢产物有18个，黄酮类代谢产物有19个，黏酸类代谢产物有15个，脂肪酸类代谢产物有17个。鞣质类化合物在体内主要的代谢途径为：水解、硫酸化、去氧、羟基化、葡萄糖醛酸化、甲基化。酚酸类化合物在体内的代谢途径主要为：葡萄糖醛酸化、硫酸化、去氧、甲基化。黄酮类化合物在体内主要发生的代谢途径为：水解、葡萄糖醛酸化、磺酸化、甲基化、羟基化。黏酸类代谢产物：黏酸类化合物及其糖苷在体内主要发生去氧，甲基化，葡萄糖醛酸化，水解等途径的代谢。脂肪酸化合物在体内主要发生的代谢途径为：去氧。