一种酸奶中真菌的检测方法与流程

本发明涉及乳品检测技术领域，特别是涉及一种酸奶中真菌的检测方法。

背景技术：

酸奶中经常发生微生物污染，微生物主要为细菌和真菌，而细菌、真菌的检测鉴定方法不同，因此需要初步区分。但酸奶中含有蛋白、胶体等物质，难以分离去除，严重干扰菌体的检测鉴定。常规分离蛋白、胶体等物质的方法，步骤繁琐，费时费力，且容易引起二次污染。另外酸奶本身含有大量乳酸菌，真菌含量相对较少，容易受到蛋白、胶体等颗粒干扰，直接镜检困难。因此需要研究一种排除干扰、快速简便地分离纯化真菌的方法，检测鉴定酸奶是否含有真菌污染。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种酸奶中真菌的检测方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种酸奶中真菌的检测方法，包括如下步骤：

1)将酸奶样品离心，去除上清以提供第一沉淀物；

2)将步骤1)所提供的第一沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第二沉淀物；

3)将步骤2)所提供的第二沉淀物与氢氧化钠反应，所得产物离心、去除上清以提供第三沉淀物；

4)将步骤3)所提供的第三沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第四沉淀物；

5)将步骤4)所提供的第四沉淀物进行菌体检测。

在本发明一些实施方式中，所述酸奶选自发酵乳。

在本发明一些实施方式中，所述步骤1)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。

在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，使用超纯水对第一沉淀物进行水洗。

在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。

在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.5～1.5mol/l。

在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，氢氧化钠的使用量为每1g酸奶样品加入20-60mg的氢氧化钠。

在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。

在本发明一些实施方式中，所述步骤4)中，使用超纯水对第三沉淀物进行水洗。

在本发明一些实施方式中，所述步骤4)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。

在本发明一些实施方式中，所述步骤5)中，将步骤4)所提供的第四沉淀物进行菌体检测的具体方法包括：将第四沉淀物进行涂片、染色。

在本发明一些实施方式中，所述步骤5)中，将第四沉淀物悬浮后进行涂片。

附图说明

图1显示为本发明实施例1的常温酸奶霉菌检测结果示意图。

图2显示为本发明实施例2的冷藏酸奶中酵母污染检测对照示意图。

图3显示为本发明实施例3的冷藏酸奶中涨包原因分析结果示意图。

图4显示为本发明实施例4的培养菌落镜检示意图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。

本发明发明人经过大量研究，提供了一种酸奶中真菌的检测方法，本发明所提供的酸奶中真菌的检测方法可以快速地分离酸奶中的真菌，并可以直接镜检观察分析，具有操作简便、成本低、处理时间短等优点，在此基础上完成了本发明。

本发明提供一种酸奶中真菌的检测方法，包括如下步骤：

1)将酸奶样品离心，去除上清以提供第一沉淀物；

2)将步骤1)所提供的第一沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第二沉淀物；

3)将步骤2)所提供的第二沉淀物与氢氧化钠水溶液混合、离心，去除上清以提供第三沉淀物；

4)将步骤3)所提供的第三沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第四沉淀物；

5)将步骤4)所提供的第四沉淀物进行菌体检测。

本发明所提供的酸奶中胶体的处理方法中，酸奶通常指发酵乳，即以生乳或乳粉为原料，经过杀菌处理(例如，巴氏杀菌)、发酵后所获得的ph值降低的乳制品，发酵过程中可以添加有益菌(例如，发酵剂)。具体可以是例如，发酵乳、风味发酵乳等；再例如，可以是常温酸奶、冷藏酸奶等；再例如，可以是符合gb19302-2010相关标准的各种发酵乳。所述酸奶中通常可以包括嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等菌体，当酸奶发生污染时，也可以进一步包括真菌等菌体，例如，酵母、霉菌等。

本发明所提供的酸奶中真菌的检测方法中，可以包括：将酸奶样品离心，去除上清以提供第一沉淀物。将酸奶样品离心，通常可以去除酸性水溶性蛋白，所提供的第一沉淀物通常为胶体、酸性不溶蛋白、脂肪、菌体等沉淀物。所述步骤1)中，具体的离心条件对于本领域技术人员来说是可以被调整的，例如，离心条件通常可以为3000-10000g、3000g-4500g、4500g-6000g、6000g-7500g、7500g-9000g、或9000g-10000g，再例如，离心时间通常可以为3-15min、3-5min、5-7min、7-9min、9-11min、11-13min、或13-15min。

本发明所提供的酸奶中真菌的检测方法中，还可以包括：将步骤1)所提供的第一沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第二沉淀物。将第一沉淀物水洗、离心，通常可以去除酸性水溶性蛋白。所提供的第二沉淀物通常包括胶体、酸性不溶蛋白、脂肪、菌体等沉淀物。本领域技术人员可选择合适的方法对第一沉淀物进行洗涤，例如，可以使用超纯水等，洗涤的过程中，可以对沉淀物进行多次洗涤，以保证能够溶于酸、但不能溶于碱的蛋白部分被充分分离。所述步骤2)中，具体的离心条件对于本领域技术人员来说是可以被调整的，例如，离心条件通常可以为3000-10000g、3000g-4500g、4500g-6000g、6000g-7500g、7500g-9000g、或9000g-10000g，再例如，离心时间通常可以为3-15min、3-5min、5-7min、7-9min、9-11min、11-13min、或13-15min。

本发明所提供的酸奶中真菌的检测方法中，还可以包括：将步骤2)所提供的第二沉淀物与氢氧化钠反应，所得产物离心、去除上清以提供第三沉淀物。将第二沉淀物与氢氧化钠反应，通常可以去除碱溶性蛋白和脂肪，所提供的第三沉淀物通常包括胶体、脂肪、极少量的菌体等沉淀物。所述步骤3)中，所加入的氢氧化钠的量通常取决于酸奶样品的称取量，例如，氢氧化钠的使用量可以为每1g酸奶样品加入20～60mg、20～30mg、30～40mg、40～50mg、或50～60mg的氢氧化钠。通常来说，可以将氢氧化钠溶于适量的水，形成氢氧化钠水溶液，将步骤2)所提供的第二沉淀物与氢氧化钠水溶液混合以进行反应。具体所使用的氢氧化钠水溶液的浓度以及第二沉淀物与氢氧化钠的反应时间对于本领域技术人员来说是可以被调整的，例如，所述氢氧化钠水溶液的浓度可以为0.5～1.5mol/l、0.5～0.7mol/l、0.7～0.9mol/l、0.9～1.1mol/l、1.1～1.3mol/l、或1.3～1.5mol/l，再例如，可以将第二沉淀物与氢氧化钠水溶液充分混合，静置3～5min、5～10min、或10～15min。所述步骤3)中，具体的离心条件对于本领域技术人员来说是可以被调整的，例如，离心条件通常可以为3000-10000g、3000g-4500g、4500g-6000g、6000g-7500g、7500g-9000g、或9000g-10000g，再例如，离心时间通常可以为3-15min、3-5min、5-7min、7-9min、9-11min、11-13min、或13-15min。

本发明所提供的酸奶中真菌的检测方法中，还可以包括：将步骤3)所提供的第三沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第四沉淀物。将第三沉淀物水洗、离心通常，通常可以去除氢氧化钠、残余的脂肪等，所提供的第四沉淀物通常包括菌体与胶体。本领域技术人员可选择合适的方法对第三沉淀物进行洗涤，例如，可以使用超纯水等，洗涤的过程中，可以对沉淀物进行多次洗涤，以保证能够充分地将第四沉淀物与其他物质分离。所述步骤4)中，具体的离心条件对于本领域技术人员来说是可以被调整的，例如，离心条件通常可以为3000-10000g、3000g-4500g、4500g-6000g、6000g-7500g、7500g-9000g、或9000g-10000g，再例如，离心时间通常可以为3-15min、3-5min、5-7min、7-9min、9-11min、11-13min、或13-15min。

本发明所提供的酸奶中真菌的检测方法中，还可以包括：将步骤4)所提供的第四沉淀物进行菌体检测。对第四沉淀物所进行的菌体检测可以直接染色，并可以通过显微镜发大1000倍进行镜检。本领域技术人员可选择合适的方法对第四沉淀物进行菌体检测，例如，可以将第四沉淀物进行涂片、染色，优选可以将第四沉淀物悬浮后进行涂片。

本发明所提供的酸奶中真菌的检测方法可以快速高效分离纯化酸奶中的真菌，并进行检测鉴定，分析结果直观高效，从而可以提高酸奶微生物污染检测速度，及时分析、解决产品质量问题，具有十分广阔的应用前景。

下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

实施例1

常温酸奶霉菌检测：

某品牌常温酸奶销售过程中发现粘度变稀，收集同品牌粘度正常和异常样品。

1)吸取1ml酸奶加入1.5ml离心管中，6000g×5min离心，弃上清。

2)加入1mlmilli-q超纯水，洗涤沉淀，6000g×5min离心弃上清。

3)沉淀加入0.5mol/ml氢氧化钠1ml,充分震荡混匀，溶解蛋白。6000g×5min离心后用枪头搅动粘在管壁上方的脂肪，弃上清，去除蛋白和脂肪。

4)再加入1mlmilli-q超纯水，6000g×5min离心洗涤沉淀2次。

5)沉淀加入100μlmilli-q悬浮沉淀，涂片、结晶紫简单染色，镜检观察。

检测结果见图1，粘度变稀样品中有霉菌菌丝体，而对照没有，提示霉菌污染是粘度变稀的可能原因。

实施例2

冷藏酸奶中酵母污染检测对照实验：

吸取异常冷藏酸奶样品1ml，离心弃上清，省去紧接着的整个水洗步骤(2)，其它操作同实施例1。镜检结果见图2，检测样品中有酵母污染。可见，省去水洗等步骤，会导致蛋白颗粒沉淀较多，视野模糊，干扰检测。导致这一结果的主要原因可能是酸奶中的酸溶、碱不溶性蛋白，加碱离心后沉淀，蛋白着色后形成颗粒。

实施例3

冷藏酸奶中涨包原因分析：

某品牌冷藏酸奶存储过程中发现涨包，收集正常和异常样品，进行检测分析。

1)称取10g酸奶样品加入50ml离心管中，10000g×3min离心弃上清。

2)加入20mlmilli-q超纯水，洗涤沉淀，10000g×3min离心弃上清。

3)沉淀加入0.2mol/ml氢氧化钠10ml,充分震荡混匀，溶解蛋白。10000g×3min离心后用枪头搅动粘在管壁上方的脂肪，弃上清，去除蛋白和脂肪。

4)再加入20mlmilli-q超纯水，10000g×3min离心洗涤沉淀2次。

5)加入1mlmilli-q悬浮沉淀，涂片、结晶紫简单染色，镜检观察。结果如图3所示，涨包酸奶样品中含有酵母，而酵母能够产气，因此，涨包的原因是酵母污染。酸奶直接镜检图像模糊，难以观察到污染酵母，充分说明分离酸奶中蛋白和胶体的重要性。

实施例4

涨包酸奶平板计数：

将实施例3中的涨包酸奶样品，按照gb4789.15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》中霉菌和酵母平板计数法对酵母进行定量检测。10倍梯度稀释样品，吸取合适稀释度样品稀释液1ml于无菌平皿内,加入20～25ml冷却至46℃的孟加拉红琼脂培养基，倾注平皿。正置平板，置28℃±1℃培养箱中培养，观察并记录培养至第5d的结果。长出的菌落，涂片，简单染色，显微镜镜检(1000×)确定为酵母，结果见图4。通过计算，样品中含有酵母为6.5×10⁴cfu/g。可见，检测方法所提供的检测结果具有很好的准确性。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。