基于生物适配体的催化发夹自组装反应检测水环境中3,3′,4,4′-四氯联苯的方法与流程

文档序号:21090278发布日期:2020-06-12 17:10阅读:来源:国知局

技术特征:

1.基于生物适配体的催化发夹自组装反应检测水环境中pcb77的方法,其特征在于,包括以下几个步骤:

(1)识别探针合成:将pcb77的适配体与引物按照摩尔比1:1的比例加入到1×tbe缓冲液中,混合均匀;将混合液加热至80~95℃,恒温3~5min;然后将混合液缓慢冷却至室温,室温冷却时间为30~60min;

所述步骤(1)中pcb77的适配体序列为seqidno.1;

所述步骤(1)的引物序列为seqidno.2;

(2)发夹探针合成:将发夹探针h1与发夹探针h2各自加入到1×tbe缓冲液中,混合均匀,将各自的混合溶液加热至80~95℃,恒温3~5min,然后置于冰上,反应时间为3~5min,最后置于室温,反应时间为30~60min;

所述步骤(2)中的发夹探针h1序列为seqidno.3;

所述步骤(2)中的发夹探针h2序列为:

5′-/cy-5/agatgtgtacctcggaaaaaatcactaggtacacatc/bhq-2/ttagtgatt-3′seqidno.4;

(3)荧光测定水样中pcb77含量,包括如下步骤:

①将步骤(1)中的识别探针和步骤(2)中的发夹探针h1与发夹探针h2按照摩尔比1:(1~1.5):(1~1.5)的比例混和均匀制得混合液;

②向步骤①制得的混合液中加入pcb77标准溶液,再用结合缓冲液定容,制备成不同浓度的检测液i,然后,将检测液i加热至30~60℃,反应时间为1~2h;反应完成后,用荧光仪测定检测液i的荧光强度,获得荧光数据,绘制标准曲线;

所述荧光数据是于激发波长635nm、发射波长660nm下测得的;

所述结合缓冲液包括如下组分:nacl的质量浓度为100~150mm,tris-hcl的质量浓度为10~20mm,mgcl2的质量浓度为1~5mm,kcl的质量浓度为1~5mm,cacl2的质量浓度为1~2mm,余量为双蒸水;

③实际水样中pcb77含量的检测:按照步骤②的步骤进行检测,向步骤①制得的混合液中加入实际水样或者实际水样的稀释液制得检测液ii,代替pcb77标准溶液,获得荧光数据,并根据步骤②制备的标准曲线,计算出实际水样中pcb77的质量浓度。

2.如权利要求1所述检测水环境中pcb77的方法,其特征在于,步骤(1)中的加热温度为80℃,恒温时间为3min,室温冷却时间为30min。

3.如权利要求1所述检测水环境中pcb77的方法,其特征在于,步骤(2)中的加热温度为80℃,恒温时间为3min,置于冰上,反应时间为3min,最后置于室温,反应时间为3min。

4.如权利要求1所述检测水环境中pcb77的方法,其特征在于,步骤①中识别探针和发夹探针h1与发夹探针h2按照摩尔比1:1:1的比例混合。

5.如权利要求1所述检测水环境中pcb77的方法,其特征在于,步骤②中结合缓冲液包括如下组分:nacl的质量浓度为100mm,tris-hcl的质量浓度为10mm,mgcl2的质量浓度为1mm,kcl的质量浓度为1mm,cacl2的质量浓度为1mm,余量为双蒸水。

6.如权利要求1所述检测水环境中pcb77的方法,其特征在于,步骤②中反应温度为30℃,反应时间为1h。

7.如权利要求1所述检测水环境中pcb77的方法,其特征在于,步骤②向步骤①制得的混合液中加入pcb77标准溶液,再用结合缓冲液定容,制备成不同浓度的检测液i,以与检测液i平行的,不含pcb77的空白液作为对照液,然后,将检测液i和对照液加热至30~60℃,反应时间为1~2h;反应完成后,用荧光仪测定检测液i和对照液的荧光强度,获得荧光数据,绘制标准曲线。

8.如权利要求7所述检测水环境中pcb77的方法,其特征在于,步骤②中检测液i中pcb77的质量浓度0.1~100μg/l;

优选的,步骤②中检测液i中pcb77的质量浓度为0.1~20μg/l。

9.如权利要求1所述检测水环境中pcb77的方法,其特征在于,步骤③检测液ii中pcb77的质量浓度为0.1~100μg/l。

10.如权利要求1-9任一项所述检测水环境中pcb77的方法,其特征在于,所述步骤③中检测结果的准确性,采用标准加入法进行验证。


技术总结
本发明涉及一种基于生物适配体的催化发夹自组装反应检测水环境中3,3′,4,4′‑四氯联苯的方法,主要通过PCB77的适配体与引物合成识别探针,在PCB77的存在条件下,适配体与PCB77结合形成稳定的结构,并释放出引物链,无酶催化发夹自组装反应被激活,引物链与发夹探针H1杂交产生双链结构,启动链置换反应打开发夹探针H2,产生荧光信号;引物链从发夹探针H1与H2上掉落,循环反应,使荧光信号扩大,获得荧光数据,绘制标准曲线,检测水体样本PCB77获得荧光数据,计算出水体样本中PCB77的含量;本发明涉及的方法操作简单,检测结果准确灵敏度高。

技术研发人员:姬丹丹;臧立华;原琳;付强
受保护的技术使用者:齐鲁工业大学
技术研发日:2020.03.24
技术公布日:2020.06.12
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