一种同时检测血清中多种抗精神病药物浓度的方法与流程

本发明属于血液检测
技术领域：
，具体涉及一种同时检测血清中多种抗精神病药物浓度的方法，其中抗精神病药物分别为：n-去甲氯氮平(n-desmethylclozapine，nczp)、奥氮平(olanzapine，ozp)、氯丙嗪(chlorpromazine，cpz)、氯氮平(clozapine，czp)、舒必利(sulpiride，spr)、氨磺必利(amisulpride，asp)、氟哌啶醇(haloperidol，hlp)、喹硫平(quetiapine，qtp)、去甲喹硫平(nqtp)、奋乃静(perphenazine，ppz)、利培酮(risperidone，rpd)、齐拉西酮(ziprasidone，zpd)、9-羟利培酮(paliperidone，ppd)、氟奋乃静(fluphenazine，fpn)、脱氢阿立哌唑(dehydroaripiprazole，dhapz)、阿立哌唑(aripiprazole，apz)
背景技术：
：抗精神病药，是一种适用于治疗精神分裂症、幻觉、躁狂、睡眠障碍和痴呆等多种精神障碍的药物。临床上已使用的抗精神病药有9大类、40余种，其中经典的抗精神病药物有吩噻嗪类、硫杂蒽类、丁酰苯类、苯酰胺类和二苯氧氮平类。然而，所有的抗精神病药物在过量使用后都可能引起不愉快的副作用和严重的中毒。当联合使用抗精神病药物时，这些问题可能会增加。不愉快的副作用常常增加精神病患者的不依从性。因此，合适的分析方法是治疗药物监测(tdm)筛选、鉴定和量化的必要手段。目前针对抗精神病药物体内浓度检测的方法主要有高效液相色谱法、超高效液相-串联质谱法，文献“screening,library-assistedidentificationandvalidatedquantificationoffifteenneurolepticsandthreeoftheirmetabolitesinplasmabyliquidchromatography/massspectrometrywithatmosphericpressurechemicalionization”报道一种检测血浆中15种精神病类药物及部分代谢物方法，但是样本用量大，需要0.5ml，前处需要过spe，成本高，一针采集需要10分钟，线性范围窄等；文献“therapeuticdrugmonitoringofsevenpsychotropicdrugsandfourmetabolitesinhumanplasmabyhplc-ms”报道一种血浆中多种精神药物及代谢物检测方法，存在前处理复杂，采样时间长，线性范围窄等。专利cn109668979a公开了一种：“一种同时检测血液样品中17种抗精神病药物的方法”，此方法进样量大，一针进样20μl；前处理复杂，需要氮吹浓缩复溶；需要过滤，成本高；采集时间长，需要9min。专利cn110455945a公开了一种检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的方法及试剂盒，此方法所需样本量大，需要100μl，一次只能检测5种药物，不能满足这类药物高通量筛查要求。此外还有专利报告针对其中一种或几种药物进行检测，效率相对比较低。存在单个样品分析时间长、灵敏度低、线性范围不适宜、样品前处理复杂和存在基质效应干扰等不足。技术实现要素：本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种同时检测血清中多种抗精神病药物浓度的方法。本发明的技术方案如下：一种同时检测血清中抗精神病药物浓度的方法，所述抗精神病药物分别为：n-去甲氯氮平(nczp)、奥氮平(ozp)、氯丙嗪(cpz)、氯氮平(czp)、舒必利(spr)、氨磺必利(asp)、氟哌啶醇(hlp)、喹硫平(qtp)、去甲喹硫平(nqtp)、奋乃静(ppz)、利培酮(rpd)、齐拉西酮(zpd)、9-羟利培酮(ppd)、氟奋乃静(fpn)、脱氢阿立哌唑(dhapz)和阿立哌唑(apz)；所述抗精神病药物对应的内标物分别为：n-去甲氯氮平-d8(nczp-d8)、奥氮平-d3(ozp-d3)、氯丙嗪-d6(cpz-d6)、氯氮平-d8(czp-d8)、舒必利-d3(spr-d3)、氨磺必利-d5(asp-d5)、氟哌啶醇-d4(hlp-d4)、喹硫平-d8(qtp-d8)、去甲喹硫平-13c4(nqtp-13c4)、奋乃静-d8(ppz-d8)、利培酮-d4(rpd-d4)、齐拉西酮-d8(zpd-d8)、9-羟利培酮-d4(ppd-d4)、氟奋乃静-d8(fpn-d8)、脱氢阿立哌唑-d8(dhapz-d8)和阿立哌唑-d8(apz-d8)；血清样本通过蛋白沉淀后，振荡、离心取上清进样，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗精神病药物，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为x轴，标准品与内标物的峰面积比为y轴，建立校准曲线，计算上述抗精神病药物的含量，具体色谱条件为：(1)超高效液相色谱条件：流动相a：0.005％～0.1％甲酸水溶液；流动相b：乙腈；色谱柱型号：watersbehc18(2.1×100mm,1.7μm)；采用流动相a和流动相b为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相a和流动相b的初始比例为80～100～20:0；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比由初始比例匀速渐变至30:70；在1.0-3.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比由2:98变至初始比例；每个样品采集时间为5.0分钟；(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为2.5kv(esi+)；源温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800l/h，锥孔气流速为150l/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相a中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用lc-ms/ms方法检测血清中抗精神病药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗癫痫药物的分离和检测。在一种优选方案中，流动相a为0.01％～0.1％甲酸水溶液，在不影响本发明效果的情况下，优选地，流动相a为0.05％甲酸水溶液。在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用乙腈和0.005％～0.1％甲酸水溶液作为流动相，色谱柱型号为watersbehc18(2.1×100mm,1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强，准确度和精密度基本满足要求。在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用n-去甲氯氮平-d8(nczp-d8)、奥氮平-d3(ozp-d3)、氯丙嗪-d6(cpz-d6)、氯氮平-d8(czp-d8)、舒必利-d3(spr-d3)、氨磺必利-d5(asp-d5)、氟哌啶醇-d4(hlp-d4)、喹硫平-d8(qtp-d8)、去甲喹硫平-13c4(nqtp-13c4)、奋乃静-d8(ppz-d8)、利培酮-d4(rpd-d4)、齐拉西酮-d8(zpd-d8)、9-羟利培酮-d4(ppd-d4)、氟奋乃静-d8(fpn-d8)、脱氢阿立哌唑-d8(dhapz-d8)和阿立哌唑-d8(apz-d8)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中的抗精神病药物时的重现性、准确度均较好。在一种优选方案中，流动相a和流动相b的初始比例为85～95:15～5。进一步优选地，流动相a和流动相b的初始比例为90:10。在一种优选方案中，流速为0.2～0.5ml/min，优选为0.3ml/min。进一步地，柱温为30～50℃，优选为45℃。在一种方案中，进样体积为0.2～5μl，优选为1μl。在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗精神病药物时，具体色谱条件为：(1)超高效液相色谱条件：流动相a：0.05％甲酸水溶液；流动相b：乙腈；色谱柱型号：watersbehc18(2.1×100mm,1.7μm)；流动相a和流动相b的初始比例为90:10；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比由90:10匀速渐变至30:70；在1.0-3.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比由2:98变至90:10；每个样品采集时间为5.0分钟。梯度洗脱方式具体见表1；流速为0.4ml/min，柱温为45℃，进样体积为1μl；表1流动相梯度洗脱参数时间(min)流速(ml/min)％a％bcurve0.00.49010-1.00.4307063.00.429865.00.490101(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为2.5kv(esi+)；源温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800l/h，锥孔气流速为150l/h；质谱源参数如表2所示，同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各个目标物的质谱参数见表3。表2质谱源参数表3抗精神病药物检测质谱参数本发明提及的血清为人或动物的血清。本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为异丙醇、甲醇与乙腈混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中异丙醇、甲醇与乙腈的体积比为1:1～3:1，更优选地，蛋白质沉淀剂中异丙醇、甲醇与乙腈的体积比1:2:1。在一种优选方案中，本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μl血清于1.5ml离心管中，向其中加入200μl含内标的蛋白质沉淀剂，振荡3～5min，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μl至塑料内衬管中，待进样；所述蛋白质沉淀剂中异丙醇、甲醇与乙腈的体积比1:2:1。在一种更优选方案中，本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μl血清于1.5ml离心管中，向其中加入200μl含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇、甲醇与乙腈的体积比为1:2:1),高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移ep管中的上清液60μl至塑料内衬管中，待进样。在一种方案中，本发明提及的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：以甲醇配制如下同位素内标母液：n-去甲氯氮平-d8(nczp-d8)0.1mg/ml、奥氮平-d3(ozp-d3)0.1mg/ml、氯丙嗪-d6(cpz-d6)0.1mg/ml、氯氮平-d8(czp-d8)1mg/ml、舒必利-d3(spr-d3)0.25mg/ml、氨磺必利-d5(asp-d5)0.1mg/ml、氟哌啶醇-d4(hlp-d4)0.01mg/ml、喹硫平-d8(qtp-d8)0.1mg/ml、去甲喹硫平-13c4(nqtp-13c4)0.1mg/ml、奋乃静-d8(ppz-d8)0.01mg/ml、利培酮-d4(rpd-d4)0.01mg/ml、齐拉西酮-d8(zpd-d8)1mg/ml、9-羟利培酮-d4(ppd-d4)0.1mg/ml、氟奋乃静-d8(fpn-d8)0.01mg/ml、脱氢阿立哌唑-d8(dhapz-d8)1mg/ml和阿立哌唑-d8(apz-d8)0.1mg/ml。分别移取各同位素内标母液：n-去甲氯氮平-d8(nczp-d8)2.5μl、奥氮平-d3(ozp-d3)5μl、氯丙嗪-d6(cpz-d6)10μl、氯氮平-d8(czp-d8)1μl、舒必利-d3(spr-d3)4μl、氨磺必利-d5(asp-d5)10μl、氟哌啶醇-d4(hlp-d4)10μl、喹硫平-d8(qtp-d8)10μl、去甲喹硫平-13c4(nqtp-13c4)10μl、奋乃静-d8(ppz-d8)25μl、利培酮-d4(rpd-d4)10μl、齐拉西酮-d8(zpd-d8)1μl、9-羟利培酮-d4(ppd-d4)5μl、氟奋乃静-d8(fpn-d8)25μl、脱氢阿立哌唑-d8(dhapz-d8)1μl和阿立哌唑-d8(apz-d8)10μl；再加入至860.5μl甲醇中得到1ml混合内标溶液。取200ul上述混合内标溶液加入至19.8ml蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。在一种方案中，上述蛋白质沉淀剂为异丙醇、甲醇与乙腈混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中异丙醇、甲醇与乙腈的体积比为1:1～3:1；更优选地，蛋白质沉淀剂中异丙醇、甲醇与乙腈的体积比为1:2:1。在一种优选方案中，本发明提及的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：以甲醇配制如下同位素内标母液：n-去甲氯氮平-d8(nczp-d8)0.1mg/ml、奥氮平-d3(ozp-d3)0.1mg/ml、氯丙嗪-d6(cpz-d6)0.1mg/ml、氯氮平-d8(czp-d8)1mg/ml、舒必利-d3(spr-d3)0.25mg/ml、氨磺必利-d5(asp-d5)0.1mg/ml、氟哌啶醇-d4(hlp-d4)0.01mg/ml、喹硫平-d8(qtp-d8)0.1mg/ml、去甲喹硫平-13c4(nqtp-13c4)0.1mg/ml、奋乃静-d8(ppz-d8)0.01mg/ml、利培酮-d4(rpd-d4)0.01mg/ml、齐拉西酮-d8(zpd-d8)1mg/ml、9-羟利培酮-d4(ppd-d4)0.1mg/ml、氟奋乃静-d8(fpn-d8)0.01mg/ml、脱氢阿立哌唑-d8(dhapz-d8)1mg/ml和阿立哌唑-d8(apz-d8)0.1mg/ml。分别移取各同位素内标母液：n-去甲氯氮平-d8(nczp-d8)2.5μl、奥氮平-d3(ozp-d3)5μl、氯丙嗪-d6(cpz-d6)10μl、氯氮平-d8(czp-d8)1μl、舒必利-d3(spr-d3)4μl、氨磺必利-d5(asp-d5)10μl、氟哌啶醇-d4(hlp-d4)10μl、喹硫平-d8(qtp-d8)10μl、去甲喹硫平-13c4(nqtp-13c4)10μl、奋乃静-d8(ppz-d8)25μl、利培酮-d4(rpd-d4)10μl、齐拉西酮-d8(zpd-d8)1μl、9-羟利培酮-d4(ppd-d4)5μl、氟奋乃静-d8(fpn-d8)25μl、脱氢阿立哌唑-d8(dhapz-d8)1μl和阿立哌唑-d8(apz-d8)10μl；再加入至860.5μl甲醇中得到1ml混合内标溶液。取200ul上述混合内标溶液加入至19.8ml蛋白沉淀剂(异丙醇、甲醇与乙腈的体积比为1:2:1)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。其中，蛋白沉淀剂中包含：n-去甲氯氮平-d8(nczp-d8)2.5ng/ml、奥氮平-d3(ozp-d3)5ng/ml、氯丙嗪-d6(cpz-d6)10ng/ml、氯氮平-d8(czp-d8)10ng/mll、舒必利-d3(spr-d3)10ng/ml、氨磺必利-d5(asp-d5)10ng/ml、氟哌啶醇-d4(hlp-d4)1ng/ml、喹硫平-d8(qtp-d8)10ng/ml、去甲喹硫平-13c4(nqtp-13c4)10ng/ml、奋乃静-d8(ppz-d8)2.5ng/ml、利培酮-d4(rpd-d4)1ng/ml、齐拉西酮-d8(zpd-d8)10ng/ml、9-羟利培酮-d4(ppd-d4)5ng/ml、氟奋乃静-d8(fpn-d8)2.5ng/ml、脱氢阿立哌唑-d8(dhapz-d8)10ng/ml和阿立哌唑-d8(apz-d8)10ng/ml。在一种方案中，本发明提及的标准品按照如下方法制备：将抗精神病药物配制成如下浓度的标准品母液：n-去甲氯氮平(nczp)2mg/ml、奥氮平(ozp)1mg/ml、氯丙嗪(cpz)5mg/ml、氯氮平(czp)5mg/ml、舒必利(spr)5mg/ml、氨磺必利(asp)2mg/ml、氟哌啶醇(hlp)2mg/ml、喹硫平(qtp)5mg/ml、去甲喹硫平(nqtp)10mg/ml、奋乃静(ppz)1mg/ml、利培酮(rpd)5mg/ml、齐拉西酮(zpd)2mg/ml、9-羟利培酮(ppd)2mg/ml、氟奋乃静(fpn)2mg/ml、脱氢阿立哌唑(dhapz)2mg/ml和阿立哌唑(apz)1mg/ml。分别移取各标准品母液：n-去甲氯氮平(nczp)20μl、奥氮平(ozp)20μl、氯丙嗪(cpz)8μl、氯氮平(czp)10μl、舒必利(spr)8μl、氨磺必利(asp)25μl、氟哌啶醇(hlp)1μl、喹硫平(qtp)10μl、去甲喹硫平(nqtp)5μl、奋乃静(ppz)1μl、利培酮(rpd)1μl、齐拉西酮(zpd)25μl、9-羟利培酮(ppd)10μl、氟奋乃静(fpn)1μl、脱氢阿立哌唑(dhapz)20μl和阿立哌唑(apz)50μl；再加入至785μl甲醇中得到1ml混合标准储备溶液。在混合标准品储备液中包含：n-去甲氯氮平(nczp)40μg/ml、奥氮平(ozp)20μg/ml、氯丙嗪(cpz)40μg/ml、氯氮平(czp)50μg/ml、舒必利(spr)40μg/ml、氨磺必利(asp)50μg/ml、氟哌啶醇(hlp)2μg/ml、喹硫平(qtp)50μg/ml、去甲喹硫平(nqtp)50μg/ml、奋乃静(ppz)1μg/ml、利培酮(rpd)5μg/ml、齐拉西酮(zpd)50μg/ml、9-羟利培酮(ppd)20μg/ml、氟奋乃静(fpn)2μg/ml、脱氢阿立哌唑(dhapz)40μg/ml和阿立哌唑(apz)50μg/ml。将上述混合标准储备溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：氯氮平(czp)、氨磺必利(asp)、喹硫平(qtp)、去甲喹硫平(nqtp)、齐拉西酮(zpd)和阿立哌唑(apz)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：5ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、1250ng/ml、2500ng/ml；n-去甲氯氮平(nczp)、氯丙嗪(cpz)、舒必利(spr)和脱氢阿立哌唑(dhapz)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml；奥氮平(ozp)和9-羟利培酮(ppd)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml；利培酮(rpd)的七个浓度点为依次为：0.5ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、125ng/ml、250ng/ml；氟哌啶醇(hlp)和氟奋乃静(fpn)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml；奋乃静(ppz)的七个浓度点为依次为：0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml。在一种优选方案中，空白血清基质为不含抗精神病目标药物的空白血清。在一种更优选方案中，本发明将混合标准品储备液以空白血清基质(不含抗精神病目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μl混合标准品储备液加入至190μl空白血清基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点。七个不同校准品样本每个浓度点取50μl于1.5ml离心管中，向其中加入200μl含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇、甲醇与乙腈的体积比为1:2:1),高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移ep管中的上清液60μl至塑料内衬管中，待进样。本发明还包括制备质控品，其中，质控品为含有抗精神病药物的空白血清，分低、中、高三个浓度分别为qc(l)、qc(m)、qc(h)；qc(l)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至5000倍。qc(m)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至500倍。qc(h)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至50倍。优选地，空白血清基质为不含抗精神病目标药物的空白血清。在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准储备溶液以不含抗精神病目标药物的空白血清配制成三个不同浓度qc(l)、qc(m)、qc(h)，具体见表4所示。表4质控品对应浓度(单位:ng/ml)qc(l)中包含：n-去甲氯氮平(nczp)8ng/ml、奥氮平(ozp)4ng/ml、氯丙嗪(cpz)8ng/ml、氯氮平(czp)10ng/ml、舒必利(spr)8ng/ml、氨磺必利(asp)10ng/ml、氟哌啶醇(hlp)0.4ng/ml、喹硫平(qtp)10ng/ml、去甲喹硫平(nqtp)10ng/ml、奋乃静(ppz)0.2ng/ml、利培酮(rpd)1ng/ml、齐拉西酮(zpd)10ng/ml、9-羟利培酮(ppd)4ng/ml、氟奋乃静(fpn)0.4ng/ml、脱氢阿立哌唑(dhapz)8ng/ml和阿立哌唑(apz)10ng/ml。qc(m)中包含：n-去甲氯氮平(nczp)80ng/ml、奥氮平(ozp)40ng/ml、氯丙嗪(cpz)80ng/ml、氯氮平(czp)100ng/ml、舒必利(spr)80ng/ml、氨磺必利(asp)100ng/ml、氟哌啶醇(hlp)4ng/ml、喹硫平(qtp)100ng/ml、去甲喹硫平(nqtp)100ng/ml、奋乃静(ppz)2ng/ml、利培酮(rpd)10ng/ml、齐拉西酮(zpd)100ng/ml、9-羟利培酮(ppd)40ng/ml、氟奋乃静(fpn)4ng/ml、脱氢阿立哌唑(dhapz)80ng/ml和阿立哌唑(apz)100ng/ml。qc(h)中包含：n-去甲氯氮平(nczp)800ng/ml、奥氮平(ozp)400ng/ml、氯丙嗪(cpz)800ng/ml、氯氮平(czp)1000ng/ml、舒必利(spr)800ng/ml、氨磺必利(asp)1000ng/ml、氟哌啶醇(hlp)40ng/ml、喹硫平(qtp)1000ng/ml、去甲喹硫平(nqtp)1000ng/ml、奋乃静(ppz)20ng/ml、利培酮(rpd)100ng/ml、齐拉西酮(zpd)1000ng/ml、9-羟利培酮(ppd)400ng/ml、氟奋乃静(fpn)40ng/ml、脱氢阿立哌唑(dhapz)800ng/ml和阿立哌唑(apz)1000ng/ml。本发明的目的是建立一种多药分析法，采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(hplc/esi-ms/ms)，用于对血清中从亚治疗浓度到超剂量浓度的16种抗精神病药进行了快速筛选、鉴别和定量分析。采用本发明的技术方案，优势如下:本发明提供一种同时检测血清中抗精神病药物浓度的方法，可以一次性对16种抗精神病药物进行检测，目标药物与代谢产物同时监测，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.0分钟之内完成血清中抗精神病药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血清中抗精神病药物的定量分析，为临床上抗精神病药物浓度监测提供简单快速的检测方法。附图说明图1为抗精神病药物标准品的提取离子流色谱图；图2为血清中抗精神病药物的提取离子流色谱图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1：一、实验材料与仪器1.材料样本来自于武汉亚洲心脏病医院2019年8月份门诊收集的血清样本。(1)仪器：xevotq-s三重四级杆质谱仪(waterscorporation)；uplci-class超高效液相色谱系统(配自动进样器，waterscorporation)；scilogexd2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(elgalabwater，英国)；多管涡旋混合仪(vortexgenie2，美国)；可调移液器(eppendorf0.5～10μl，10～100μl，100～1000μl)；玻璃仪器、量筒等。(2)试剂耗材：ms级甲醇(fisher，美国)；hplc级甲醇(honeywell，美国)；ms级乙腈(fisher，美国)；hplc级乙腈(honeywell，美国)；hplc级异丙醇(honeywell，美国)；ms级甲酸(fisher，美国)；色谱柱型号：watersbehc18(2.1×100mm,1.7μm)(waterscorporation)。(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见表5。表5标准品和内标(4)质控品：含有抗精神病药物的空白血清，分低、中、高三个浓度分别为qc(l)、qc(m)、qc(h)，具体见表4所示。二、液质条件(1)色谱条件：流动相a：0.05％甲酸水溶液；流动相b：乙腈。色谱柱型号：watersbehc18(2.1×100mm，1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.4ml/min，柱温为45℃，进样体积为1μl。(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为2.5kv(esi+)；源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800l/h，锥孔气流速为150l/h；质谱源参数如表2所示，同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各个目标物的质谱参数见表3。三、实验过程(1)标准品配制：将抗精神病药物配制成如下浓度的标准品母液：n-去甲氯氮平(nczp)2mg/ml、奥氮平(ozp)1mg/ml、氯丙嗪(cpz)5mg/ml、氯氮平(czp)5mg/ml、舒必利(spr)5mg/ml、氨磺必利(asp)2mg/ml、氟哌啶醇(hlp)2mg/ml、喹硫平(qtp)5mg/ml、去甲喹硫平(nqtp)10mg/ml、奋乃静(ppz)1mg/ml、利培酮(rpd)5mg/ml、齐拉西酮(zpd)2mg/ml、9-羟利培酮(ppd)2mg/ml、氟奋乃静(fpn)2mg/ml、脱氢阿立哌唑(dhapz)2mg/ml和阿立哌唑(apz)1mg/ml。分别移取各标准品母液：n-去甲氯氮平(nczp)20μl、奥氮平(ozp)20μl、氯丙嗪(cpz)8μl、氯氮平(czp)10μl、舒必利(spr)8μl、氨磺必利(asp)25μl、氟哌啶醇(hlp)1μl、喹硫平(qtp)10μl、去甲喹硫平(nqtp)5μl、奋乃静(ppz)1μl、利培酮(rpd)1μl、齐拉西酮(zpd)25μl、9-羟利培酮(ppd)10μl、氟奋乃静(fpn)1μl、脱氢阿立哌唑(dhapz)20μl和阿立哌唑(apz)50μl；再加入至785μl甲醇中得到1ml混合标准储备溶液。在混合标准品储备液中包含：n-去甲氯氮平(nczp)40μg/ml、奥氮平(ozp)20μg/ml、氯丙嗪(cpz)40μg/ml、氯氮平(czp)50μg/ml、舒必利(spr)40μg/ml、氨磺必利(asp)50μg/ml、氟哌啶醇(hlp)2μg/ml、喹硫平(qtp)50μg/ml、去甲喹硫平(nqtp)50μg/ml、奋乃静(ppz)1μg/ml、利培酮(rpd)5μg/ml、齐拉西酮(zpd)50μg/ml、9-羟利培酮(ppd)20μg/ml、氟奋乃静(fpn)2μg/ml、脱氢阿立哌唑(dhapz)40μg/ml和阿立哌唑(apz)50μg/ml。将上述混合标准储备溶液以空白血清基质(不含抗精神病目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：氯氮平(czp)、氨磺必利(asp)、喹硫平(qtp)、去甲喹硫平(nqtp)、齐拉西酮(zpd)和阿立哌唑(apz)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：5ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、1250ng/ml、2500ng/ml；n-去甲氯氮平(nczp)、氯丙嗪(cpz)、舒必利(spr)和脱氢阿立哌唑(dhapz)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml；奥氮平(ozp)和9-羟利培酮(ppd)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml；利培酮(rpd)的七个浓度点为依次为：0.5ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、125ng/ml、250ng/ml；氟哌啶醇(hlp)和氟奋乃静(fpn)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml；奋乃静(ppz)的七个浓度点为依次为：0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml。(2)含内标的蛋白沉淀剂配制以甲醇配制如下同位素内标母液：n-去甲氯氮平-d8(nczp-d8)0.1mg/ml、奥氮平-d3(ozp-d3)0.1mg/ml、氯丙嗪-d6(cpz-d6)0.1mg/ml、氯氮平-d8(czp-d8)1mg/ml、舒必利-d3(spr-d3)0.25mg/ml、氨磺必利-d5(asp-d5)0.1mg/ml、氟哌啶醇-d4(hlp-d4)0.01mg/ml、喹硫平-d8(qtp-d8)0.1mg/ml、去甲喹硫平-13c4(nqtp-13c4)0.1mg/ml、奋乃静-d8(ppz-d8)0.01mg/ml、利培酮-d4(rpd-d4)0.01mg/ml、齐拉西酮-d8(zpd-d8)1mg/ml、9-羟利培酮-d4(ppd-d4)0.1mg/ml、氟奋乃静-d8(fpn-d8)0.01mg/ml、脱氢阿立哌唑-d8(dhapz-d8)1mg/ml和阿立哌唑-d8(apz-d8)0.1mg/ml；分别移取各同位素内标母液：n-去甲氯氮平-d8(nczp-d8)2.5μl、奥氮平-d3(ozp-d3)5μl、氯丙嗪-d6(cpz-d6)10μl、氯氮平-d8(czp-d8)1μl、舒必利-d3(spr-d3)4μl、氨磺必利-d5(asp-d5)10μl、氟哌啶醇-d4(hlp-d4)10μl、喹硫平-d8(qtp-d8)10μl、去甲喹硫平-13c4(nqtp-13c4)10μl、奋乃静-d8(ppz-d8)25μl、利培酮-d4(rpd-d4)10μl、齐拉西酮-d8(zpd-d8)1μl、9-羟利培酮-d4(ppd-d4)5μl、氟奋乃静-d8(fpn-d8)25μl、脱氢阿立哌唑-d8(dhapz-d8)1μl和阿立哌唑-d8(apz-d8)10μl；再加入至860.5μl甲醇中得到1ml混合内标溶液。取200μl上述混合内标溶液加入至19.8ml蛋白沉淀剂(异丙醇、甲醇与乙腈的体积比为1:2:1)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。其中，蛋白沉淀剂中包含：n-去甲氯氮平-d8(nczp-d8)2.5ng/ml、奥氮平-d3(ozp-d3)5ng/ml、氯丙嗪-d6(cpz-d6)10ng/ml、氯氮平-d8(czp-d8)10ng/mll、舒必利-d3(spr-d3)10ng/ml、氨磺必利-d5(asp-d5)10ng/ml、氟哌啶醇-d4(hlp-d4)1ng/ml、喹硫平-d8(qtp-d8)10ng/ml、去甲喹硫平-13c4(nqtp-13c4)10ng/ml、奋乃静-d8(ppz-d8)2.5ng/ml、利培酮-d4(rpd-d4)1ng/ml、齐拉西酮-d8(zpd-d8)10ng/ml、9-羟利培酮-d4(ppd-d4)5ng/ml、氟奋乃静-d8(fpn-d8)2.5ng/ml、脱氢阿立哌唑-d8(dhapz-d8)10ng/ml和阿立哌唑-d8(apz-d8)10ng/ml。(3)质控品配制：qc(l)中包含：n-去甲氯氮平(nczp)8ng/ml、奥氮平(ozp)4ng/ml、氯丙嗪(cpz)8ng/ml、氯氮平(czp)10ng/ml、舒必利(spr)8ng/ml、氨磺必利(asp)10ng/ml、氟哌啶醇(hlp)0.4ng/ml、喹硫平(qtp)10ng/ml、去甲喹硫平(nqtp)10ng/ml、奋乃静(ppz)0.2ng/ml、利培酮(rpd)1ng/ml、齐拉西酮(zpd)10ng/ml、9-羟利培酮(ppd)4ng/ml、氟奋乃静(fpn)0.4ng/ml、脱氢阿立哌唑(dhapz)8ng/ml和阿立哌唑(apz)10ng/ml。qc(m)中包含：n-去甲氯氮平(nczp)80ng/ml、奥氮平(ozp)40ng/ml、氯丙嗪(cpz)80ng/ml、氯氮平(czp)100ng/ml、舒必利(spr)80ng/ml、氨磺必利(asp)100ng/ml、氟哌啶醇(hlp)4ng/ml、喹硫平(qtp)100ng/ml、去甲喹硫平(nqtp)100ng/ml、奋乃静(ppz)2ng/ml、利培酮(rpd)10ng/ml、齐拉西酮(zpd)100ng/ml、9-羟利培酮(ppd)40ng/ml、氟奋乃静(fpn)4ng/ml、脱氢阿立哌唑(dhapz)80ng/ml和阿立哌唑(apz)100ng/ml。qc(h)中包含：n-去甲氯氮平(nczp)800ng/ml、奥氮平(ozp)400ng/ml、氯丙嗪(cpz)800ng/ml、氯氮平(czp)1000ng/ml、舒必利(spr)800ng/ml、氨磺必利(asp)1000ng/ml、氟哌啶醇(hlp)40ng/ml、喹硫平(qtp)1000ng/ml、去甲喹硫平(nqtp)1000ng/ml、奋乃静(ppz)20ng/ml、利培酮(rpd)100ng/ml、齐拉西酮(zpd)1000ng/ml、9-羟利培酮(ppd)400ng/ml、氟奋乃静(fpn)40ng/ml、脱氢阿立哌唑(dhapz)800ng/ml和阿立哌唑(apz)1000ng/ml。(4)样品处理1)标准品处理：七个不同校准品样本每个浓度点取50μl于1.5ml离心管中，向其中加入200μl含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇、甲醇与乙腈的体积比为1:2:1)，高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移ep管中的上清液60μl至塑料内衬管中，进样量1μl。2)血清样品前处理：取50μl血清于1.5ml离心管中，向其中加入200μl含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇、甲醇与乙腈的体积比为1:2:1),高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移ep管中的上清液60μl至塑料内衬管中，进样量1μl。3)质控品前处理：分别取质控品溶液qc(l)、qc(m)、qc(h)各50μl于1.5ml离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。四、方法验证1.提取离子流色谱图：抗精神病药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗精神病药物标准品提取离子流色谱图，图2为血清中抗精神病药物提取离子流色谱图。2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用targetlynx软件以标准物与内标物的浓度比为x轴，标准物与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。抗精神病药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表6。表6抗精神病药物线性回归方程及线性相关系数3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品，以相同步骤重复处理测定5次，结果显示，抗精神病药物的加标回收率在93.84％-108.65％之间，5次重复试验的rsd在0.51％-10.35％范围，统计结果见表7。表7抗精神病药物添加回收率结果4.精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度抗精神病药物标准品，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗精神病药物的浓度，批内精密度为0.96％-14.33％，三日内分3批处理，计算批间精密度为3.29％-11.89％，结果见表8。表8批内及批间精密度测试结果五、讨论本发明采用id-uplc-ms/ms方法测定了人体血清中的抗精神病药物的浓度。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗精神病药物的加标回收率为93.84％-108.65％之间，5次重复试验的rsd为0.51％-10.35％，准确度良好。方法的重现性结果表明，抗精神病药物的批内精密度为0.96％-14.33％，批间精密度为3.29％-11.89％。且建立的血清样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血清用量仅50μl。总之，本发明的检测方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，5.0分钟之内可完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清抗精神病药物浓度的定量分析，为临床上抗精神病药物浓度治疗监测提供一种可靠的检测方法。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12