一种孕马尿中结合雌激素含量的测定方法与流程

本发明涉及化学检测技术领域，尤其涉及一种孕马尿中结合雌激素含量的测定方法。

背景技术：

结合雌激素是从孕马尿中提取的一种天然混合雌激素。临床上主要用于激素代替疗法，缓解因雌激素不足引起的临床症状。每升孕马尿中富含雌激素的平均含量为70～130mg，每匹孕马在孕期内可形成雌激素5～100g。

但孕马尿中含有大量的可溶性杂质，如无机盐、尿素、糖类、黄酮及异黄酮等、酚类及多酚类成分等，这些成分是孕马的代谢产物，其中酚类及多酚类对结合雌激素成分的hplc检测分离度有影响，同时还含有不可溶性杂质，如尿内存在的不溶性盐类，具体的如已经产生的沉淀及存放过程中产生的沉淀：碳酸钙、碳酸氢钙、磷酸钙、磷酸氢钙等钙盐碳酸盐、草酸盐等，目前的处理方法包括以下几种：1离心法，孕马尿离心后，稀释，进样，该方法只能针对机械杂质，可去除大部分不溶性杂质；2自然沉降法，取沉降过的澄清孕马尿上清液过滤，稀释，进样，该方法只能去除大的机械杂质和部分其它不溶性杂质；3有机溶解沉降法，将孕马尿用一定倍数的甲醇、乙醇、丙酮沉降杂质后，稀释，进样，该方法可去除大部分不溶性杂质和部分尿内盐类杂质；4过滤法，孕马尿直接过滤，稀释进样，该方法只能去除大部分不溶性杂质。上述方法获得的待测品用于hplc检测，存在分离度差且准确率低的问题。

技术实现要素：

本发明提供了一种孕马尿中结合雌激素含量的测定方法，本发明提供的方法利用无机盐对孕马尿进行前处理，能够高效、准确地检测出孕马尿中结合雌激素的含量。

本发明提供了一种孕马尿中结合雌激素含量的测定方法，包括以下步骤：

将孕马尿与无机酸混合进行前处理，然后用碱性物质调节ph至7.0～8.0，得到供试品溶液；

将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，以保留时间定性，以标准方程计算得到结合雌激素的含量，所述标准方程是以结合雌激素的浓度为自变量、峰面积为因变量的方程；所述结合雌激素包括雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-双氢马烯雌酮硫酸钠中的一种或多种；

所述高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：c18柱；

色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；

流动相：包括a相和b相，其中a相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述a相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/l，ph值为3.5；所述a相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；b相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述b相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/l，ph值为3.5；所述b相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；

流动相洗脱程序为：0～18min，a相体积分数由70％逐渐降低为67％；18～23min，a相体积分数由67％逐渐降低为20％；23～28min，a相体积分数由20％逐渐升高为70％；28～35min，a相体积分数稳定在70％；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

检测波长：205nm；

进样量：20μl；

不同结合雌激素在同一色谱条件下的不同保留时间处出峰。

优选地，所述无机酸为盐酸溶液，所述盐酸溶液的浓度为0.1～3mol/l。

优选地，所述孕马尿与无机酸的体积比为1:1～20:1。

优选地，所述碱性物质为naoh水溶液，所述naoh水溶液的浓度为0.1～3mol/l。

优选地，所述调节ph至7.0～8.0后还包括用0.22μm过滤膜过滤两次后取续滤液作为所述供试品溶液。

优选地，所述孕马尿离心处理后再与无机酸混合，所述离心处理的时间为10～30min，转速为4000～6000转/分。

优选地，所述标准方程的测定包括以下步骤：

分别配制17α-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠的二级标准品待测溶液；

分别将所述二级标准品待测溶液进行高效液相色谱检测，分别得到二级标准品的色谱图；

所述高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：c18柱；

色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；

流动相：包括a相和b相，其中a相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述a相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/l，ph值为3.5；所述a相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；b相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述b相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/l，ph值为3.5；所述b相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；

流动相洗脱程序为：0～18min，a相体积分数由70％逐渐降低为67％；18～23min，a相体积分数由67％逐渐降低为20％；23～28min，a相体积分数由20％逐渐升高为70％；28～35min，a相体积分数稳定在70％；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

检测波长：205nm；

进样量：20μl；

根据所述二级标准品的色谱图，分别以17α-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠的浓度为自变量、峰面积为因变量，得到标准方程。

优选地，所述二级标准品待测溶液的溶剂均为甲醇-水的混合液，所述混合液中甲醇与水的体积比为1:1，所述混合液的ph值为9.0。

优选地，用tris缓冲溶液将所述混合液的ph值调节为9.0。

有益效果：

本发明提供了一种孕马尿中结合雌激素含量的测定方法，包括以下步骤：将孕马尿与无机酸混合进行前处理，然后用碱性物质调节ph至7.0～8.0，得到供试品溶液；将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，以保留时间定性，以标准方程计算得到结合雌激素的含量，所述标准方程是以结合雌激素的浓度为自变量、峰面积为因变量的方程；所述结合雌激素包括雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-双氢马烯雌酮硫酸钠中的一种或多种。本发明利用无机酸对孕马尿进行了前处理，再用碱性物质调节ph值，可以去掉孕马尿中含有的大量碳酸盐和草酸盐，大大提高检测效率，且孕马尿中的结合雌激素多数呈缀合状态，经过酸处理可以测定孕马尿中结合雌激素的总量，将缀合物中的结合雌激素释放出来，使得测定结果稳定。孕马尿中的碳酸盐遇到无机酸会形成中性盐、水和二氧化碳气体，从而提高柱效，进而能够解决孕马尿hplc测定结合雌激素含量时所遇到的，每次测定不到30个样品、柱压升高以及柱效降低等诸多问题，保证了样品含量测定准确性，为生产提供可靠的数据。且利用碱性物质调节ph值为7.0～8.0，这是因为：a、碱性条件下，结合雌激素的存在状态相对稳定；b、孕马尿本身的ph值约为7.5～8.5，调节至偏碱性(7.0～8.0)更接近孕马尿原有条件；c、偏碱性时检测结果的真实性与重现性均具有优势。实施例中考察了该方法的测定结果稳定性，对孕马尿中结合雌激素含量影响等因素，结果显示该方法处理后测定结果和孕马尿用水稀释(两种方法稀释倍数相同)后测定结果高度一致，不存在测定结果不稳定情况，而且从hplc图谱峰形来看，酸碱处理方法处理的样品hplc图谱峰形比水稀释直接测定样品峰形好，减少杂质峰干扰情况，可以将此方法作为hplc测定孕马尿中结合雌激素成分的首选方法，通过方法学验证实验，进一步确定了该方法的可行性。

附图说明

图1为17a-双氢马烯雌酮硫酸钠的标准曲线；

图2为马烯雌酮硫酸钠的标准曲线；

图3为雌酮硫酸钠的标准曲线；

图4为供试品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种孕马尿中结合雌激素含量的测定方法，包括以下步骤：

将孕马尿与无机酸混合进行前处理，然后用碱性物质调节ph至7.0～8.0，得到供试品溶液；

将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，以保留时间定性，以标准方程计算得到结合雌激素的含量，所述标准方程是以结合雌激素的浓度为自变量、峰面积为因变量的方程；所述结合雌激素包括雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-双氢马烯雌酮硫酸钠中的一种或多种；

所述高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：c18柱；

色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；

流动相：包括a相和b相，其中a相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述a相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/l，ph值为3.5；所述a相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；b相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述b相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/l，ph值为3.5；所述b相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；

流动相洗脱程序为：0～18min，a相体积分数由70％逐渐降低为67％；18～23min，a相体积分数由67％逐渐降低为20％；23～28min，a相体积分数由20％逐渐升高为70％；28～35min，a相体积分数稳定在70％；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

检测波长：205nm；

进样量：20μl；

不同结合雌激素在同一色谱条件下的不同保留时间处出峰。

本发明将孕马尿与无机酸混合进行前处理，然后用碱性物质调节ph至7.0～8.0，得到供试品溶液。

在本发明中，所述无机酸优选为盐酸溶液，所述盐酸溶液的浓度优选为0.1～3mol/l，更优选为1mol/l。

在本发明中，所述孕马尿与无机酸的体积比优选为1:1～20:1，更优选为5:1。

在本发明中，所述碱性物质优选为naoh水溶液，所述naoh水溶液的浓度优选为0.1～3mol/l，更优选为1mol/l。

在本发明中，所述调节ph至7.0～8.0后优选还包括用0.22μm过滤膜过滤两次后取续滤液作为所述供试品溶液。

在本发明中，所述孕马尿优选离心处理后再与无机酸混合，所述离心处理的时间优选为10～30min，转速优选为4000～6000转/分。

在本发明的具体实施例中，优选为取25ml孕马尿置于50ml离心管中，离心10min(转速为4000转/分)后，精密吸取5.0ml孕马尿置于100ml量瓶中，加水约50ml，再加1ml的1mol/l盐酸溶液后迅速振摇至充分反应，用1mol/lnaoh溶液调整ph至7.0～8.0后，用纯化水稀释至刻度，摇匀，用0.22μm过滤膜过滤两次后取续滤液作为供试品溶液。

得到供试品溶液后，本发明将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，以保留时间定性，以标准方程计算得到结合雌激素的含量，所述标准方程是以结合雌激素的浓度为自变量、峰面积为因变量的方程；所述结合雌激素包括雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-双氢马烯雌酮硫酸钠中的一种或多种；

所述高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：c18柱；

色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；

流动相：包括a相和b相，其中a相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述a相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/l，ph值为3.5；所述a相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；b相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述b相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/l，ph值为3.5；所述b相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；

流动相洗脱程序为：0～18min，a相体积分数由70％逐渐降低为67％；18～23min，a相体积分数由67％逐渐降低为20％；23～28min，a相体积分数由20％逐渐升高为70％；28～35min，a相体积分数稳定在70％；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

检测波长：205nm；

进样量：20μl；

不同结合雌激素在同一色谱条件下的不同保留时间处出峰。

在本发明中，所述标准方程的测定优选包括以下步骤：

分别配制17α-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠的二级标准品待测溶液；

分别将所述二级标准品待测溶液进行高效液相色谱检测，分别得到二级标准品的色谱图；

所述高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：c18柱；

色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；

流动相：包括a相和b相，其中a相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述a相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/l，ph值为3.5；所述a相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；b相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述b相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/l，ph值为3.5；所述b相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；

流动相洗脱程序为：0～18min，a相体积分数由70％逐渐降低为67％；18～23min，a相体积分数由67％逐渐降低为20％；23～28min，a相体积分数由20％逐渐升高为70％；28～35min，a相体积分数稳定在70％；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

检测波长：205nm；

进样量：20μl；

根据所述二级标准品的色谱图，分别以17α-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠的浓度为自变量、峰面积为因变量，得到标准方程。

在本发明中，所述二级标准品待测溶液的溶剂优选均为甲醇-水的混合液，所述混合液中甲醇与水的体积比优选为1:1，所述混合液的ph值优选为9.0。

在本发明中，优选用tris缓冲溶液将所述混合液的ph值调节为9.0。

在本发明的具体实施例中，优选为分别取17a-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠的二级标准品，精密称定，分别置于100ml的容量瓶中，用甲醇-水(1:1，v/v)(用tris缓冲溶液调整ph为9.0)稀释至刻度，摇匀，则得到浓度分别约为：17a-双氢马烯雌酮硫酸钠：150μg/ml，马烯雌酮硫酸钠：200μg/ml，雌酮硫酸钠：400μg/ml的对照储备溶液。在分别取2ml各对照储备溶液置于100ml的容量瓶中，用甲醇-水(1:1，v/v)(用tris缓冲溶液调整ph为9.0)稀释至刻度，摇匀，则得到浓度为：17a-双氢马烯雌酮硫酸钠：3μg/ml，马烯雌酮硫酸钠：4μg/ml，雌酮硫酸钠：8μg/ml的对照溶液。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

在以下实施例中，供试品溶液为来自不同某牧区、不同孕期的孕马尿，不同某牧区、不同孕期的孕马尿中17a-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠的含量是存在差异的。

实施例1

1实验材料及仪器

(1)试剂

甲醇(hplc级)、乙腈(hplc级)、纯化水、磷酸二氢钠(分析纯)、磷酸氢二钠(分析纯)、1mol/l盐酸溶液、1mol/l氢氧化钠溶液。

(2)标准品

17a-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠标准品和雌酮硫酸钠标准品。

(3)仪器

高效液相色谱仪(二元泵，自动进样器，dad检测器)，电子天平(十万分之一)，离心机(4000转/分钟)。

2色谱条件

色谱柱：c18柱(250mm×4.6mm，5μm)流动相a：20mmol/l磷酸二氢钠，用磷酸调ph至3.5，磷酸二氢钠：乙腈：甲醇＝17:2:1；流动相b：10mmol/l磷酸氢二钠，用磷酸调ph至6.5，磷酸氢二钠：乙腈＝3:7。流动相的洗脱程序为：0～18min，70％a～67％a，18～23min，67％a～20％a，23～28min，20％a～70％a，28～35min，70％a～70％a。流速为1.0ml/min，检测波长205nm，进样量20μl，柱温40℃，采集时间35min。

3对照品

分别取17a-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠的二级标准品，精密称定，分别置于100ml的容量瓶中，用甲醇-水(1:1，v/v)(用tris缓冲溶液调整ph为9.0)稀释至刻度，摇匀，则得到浓度分别约为：17a-双氢马烯雌酮硫酸钠：150μg/ml，马烯雌酮硫酸钠：200μg/ml，雌酮硫酸钠：400μg/ml的对照储备溶液。在分别取2ml各对照储备溶液置于100ml的容量瓶中，用甲醇-水(1:1，v/v)(用tris缓冲溶液调整ph为9.0)稀释至刻度，摇匀，则得到浓度为：17a-双氢马烯雌酮硫酸钠：3μg/ml，马烯雌酮硫酸钠：4μg/ml，雌酮硫酸钠：8μg/ml的对照溶液。

4供试品溶液的制备

取25ml孕马尿(某牧区)置于50ml离心管中，离心10min(转速为4000转/分)后，精密吸取5.0ml孕马尿置于100ml量瓶中，加水约50ml，再加1ml的1mol/l盐酸溶液后迅速振摇至充分反应，用1mol/lnaoh溶液调整ph至7.0～8.0后，用纯化水稀释至刻度，摇匀，用0.22μm过滤膜过滤两次后取续滤液作为供试品溶液。供试品为两个平行样。

5测定方法

20μl对照品溶液进样，经hplc检测，雌酮硫酸钠和马烯雌酮硫酸钠、17a-双氢马烯雌酮硫酸钠的分离度不小于2.0，以雌酮硫酸钠计拖尾因子应不大于1.3，理论塔板数以雌酮硫酸钠计不少于10000。

6测定结果

6.1标准曲线的绘制

表1为不同浓度对照溶液的配制。

表1不同浓度对照溶液的配制

分别精密吸取空白溶液1针、对照品溶液至少4针、每个线性水平各进2针、1针对照品溶液回校。照上述色谱条件下进行测定。在结果中，应报告所有单个点的值；以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制所有点的峰面积-浓度曲线；计算回归方程(x为浓度，y为峰面积)；计算相关系数r²、y轴截距和回归曲线斜率。相关系数r²应不小于0.999；y轴截距在100％响应值的2.0％以内。(y轴截距在100％响应值的2.0％以内指的是：x＝标准规定的对照品溶液的浓度时，所得到的y值，用截距除以这个y值乘以100％，应该小于2.0％。)注：3种成分分别计算或绘制曲线。

得到的17a-双氢马烯雌酮硫酸钠的标准曲线如图1所示，标准曲线方程为y＝54858.7824x-138.9793，r²＝1.0000；马烯雌酮硫酸钠的标准曲线如图2所示，标准曲线方程为y＝60422.1204x-30.7424，r²＝1.0000；雌酮硫酸钠的标准曲线如图3所示，标准曲线方程为y＝66099.3479x+72.7473，r²＝1.0000，y轴截距在100％响应值分别为0.1％、0.02％、0.01％。

6.2检测结果

图4为供试品溶液的高效液相色谱图。

根据标准方程，得出孕马尿中各结合雌激素成分的含量结果如表2所示。

表2孕马尿中各结合雌激素成分的含量

7方法学考察

7.1系统适用性：检测系统能够准确的进行样品检测，数据准确。

可接受标准：雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17a-双氢马烯雌酮硫酸钠的分离度应不低于2.0；以雌酮硫酸钠计拖尾因子应不大于1.3；主峰以雌酮硫酸钠计理论塔板数应不低于10000。至少4针对照品溶液主峰以雌酮硫酸钠面积计rsd应不大于3.0％。

验证方法：(1)分别按照流动相空白(即空针)1针，对照品溶液至少4针，进行色谱进样检测，并记录色谱图；

验证结果：

表3agilent1260(a)系统适用性

7.2准确度

可接受标准：各浓度下的平均回收率应该在90％-110％之间；总回收率的rsd应不大于15.0％，相同浓度样品的rsd不大于15.0％；

验证方法

对照品溶液各平行配制3份。

表4不同浓度溶液的配制

测定

(1)分别按照流动相空白(即空针)1针，对照品溶液至少4针，50％浓度对照、100％浓度对照、200％浓度对照，同浓度每份对照溶液水平各进3针，每10针样品溶液后回校对照品溶液1，注入液相色谱仪进行测定。

实测值：c1/a1＝c2/a2

a1：对照品峰面积，

c1：对照品的实际浓度，

a2：不同浓度对照品峰面积

c2：不同浓度对照品的实际浓度

回收率＝实测值/理论值×100％(理论值：储备液浓度/稀释倍数)

验证结果如表5～7所示，其中表5为17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的验证结果，表6为马烯雌酮硫酸钠的验证结果，表7为雌酮硫酸钠的验证结果，可知，17α-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠的回收率均在90.0％-110.0％间，且rsd值(n＝9)分别为5.6％、1.2％、3.1％，不同浓度梯度下(50％、100％、200％)的17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的rsd值(n＝3)分别为0.3％、0.9％、1.0％，马烯雌酮硫酸钠的rsd值(n＝3)分别为0.3％、1.6％、0.5％，雌酮硫酸钠的rsd值(n＝3)分别为0.6％、1.6％、1.0％均小于15.0％。

表5准确度验证结果

表6马烯雌酮硫酸钠的验证结果

表7雌酮硫酸钠的验证结果

7.3精密度

可接受标准：重复性标准：其6份平行供试品溶液(采自某牧区的孕马尿)含量的rsd值，应不大于15.0％，

中间精密度标准：rsd应不大于15.0％；不同时间、不同检测人员、不同仪器之间rsd应不大于15.0％。

表8为精密度结果。

表8精密度结果

7.4重复性

a:重复性供试品溶液。

b:供试品分别平行配制6份供试品溶液

c:分别按照流动相空白(即空针)1针，对照品溶液至少4针，供试品溶液(采自某牧区的孕马尿)6分平行样各1针，回校对照品溶液1针，注入液相色谱仪，记录色谱图。

d:测试结果，

表9为重复性结果，由表9可知，经检测重复性结果中6个平行样间的rsd值为1.4％小于15.0％。

表9重复性结果

7.4检测限和定量限

检测限

a)取空白连续进样3次的图谱，记录在工作对照品主峰出峰时间范围内的基线噪声水平，计算平均噪声。

b)准确配制工作标准储备液，逐步稀释至一定浓度并进样。计算其峰高与平均噪声的比值，其信噪比为3±1:1。

定量限(loq)

a)空白连续进样3次，记录在对照品主峰出峰时间范围内的基线噪声水平，计算平均噪声。

b)准确配制标准储备液，逐步稀释至一定浓度并进样。计算其峰高与平均噪声的比值，其信噪比为10±2:1。

结论：

经检测岛津2030的lod17α-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠的信噪比为11、11、12时的浓度分别为0.0026μg/ml、0.0035μg/ml、0.0042μg/ml。岛津2030的loq17α-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、雌酮硫酸钠的信噪比为36、36、33时的浓度分别为0.0080μg/ml、0.0086μg/ml、0.0083μg/ml。

7.5稳定性测试

孕马尿酸碱处理方法虽然有效解决了色谱柱压力升高，柱效降低等问题，但是考虑到实际处理样品过程中所反映的，同一个样品同样方法处理结果缺乏重复性的问题，进行孕马尿酸碱处理方法测定结果稳定性考察试验。

试验方法

5批孕马尿样品各取50ml，4000r/min离心10min，取上清液置于干净离心管中；样品保存在冰箱中防止含量降低。

第0天样品处理

样品处理：每批孕马尿各取2.5ml置于50ml容量瓶中，加入0.5ml稀盐酸完全摇匀(消除形成的气泡)，迅速加入0.5ml2m氢氧化钠溶液摇匀，加水稀释到刻度，过滤，进样，样品编号x-1。

孕马尿水稀释直接测定

每批孕马尿(采自某牧区的孕马尿)各取2.5ml置于50ml容量瓶中，加水稀释到刻度，过滤，进样；样品编号x-2。

每批样品各处理两份平行样，计算各平行样测定结果之间的偏离度。

第0天样品处理测定结果和有关统计结果见表10。由表10可知，结论：各平行样含量差异不大，17α-双氢马烯雌酮硫酸钠rsd值2.64，马烯雌酮硫酸钠rsd值3.92，雌酮硫酸钠rsd值2.36.

表明酸碱处理方法测定孕马尿中，17α-双氢马烯雌酮硫酸钠，马烯雌酮硫酸钠，雌酮硫酸钠含量，方法重复性良好。

表10第0天样品处理测定结果

第1天样品处理

样品处理：每批样品各取两份按以下两种不同的方法处理

酸碱处理

每批孕马尿各取2.5ml置于50ml容量瓶中，加入0.5ml稀盐酸完全摇匀(消除形成的气泡)，迅速加入0.5ml2m氢氧化钠溶液摇匀，加水稀释到刻度，过滤，进样；样品编号x-1。

孕马尿水稀释直接测定

每批孕马尿各取2.5ml置于50ml容量瓶中，加水稀释到刻度，过滤，进样；样品编号x-2。

第1天样品处理测定结果和有关统计结果见表11。结论：由于hplc柱子的原因第1天测定结果比第0天测定结果高，两种处理方法同时处理的样品，冰箱里保存7天后同时测定，结果显示两种处理方法测定结果差异在可以允许范围之内。表明酸碱处理对马尿中结合雌激素含量影响很小，不会导致含量显著降低。

不同方法处理样含量差异不大，17α-双氢马烯雌酮硫酸钠rsd值2.60，马烯雌酮硫酸钠rsd值4.63，雌酮硫酸钠rsd值5.79。

表明孕马尿酸碱处理方法和水稀释直接进样测定结果一致，酸碱处理样品不存处理结果不平行和导致结合雌激素含量降低的可能性。

表11第1天样品处理测定结果

第11天样品处理

样品处理：每批样品各取两份按以下两种不同的方法处理

酸碱处理

每批孕马尿各取2.5ml置于50ml容量瓶中，加入0.5ml稀盐酸完全摇匀(消除形成的气泡)，迅速加入0.5ml2m氢氧化钠溶液摇匀，加水稀释到刻度，过滤，进样；样品编号x-1。

孕马尿水稀释直接测定

每批孕马尿各取2.5ml置于50ml容量瓶中，加水稀释到刻度，过滤，进样；样品编号x-2。

第11天样品处理测定结果和有关统计结果见表12。结论：本该第二天处理的样品，因hplc柱子的原因没有按时处理，样品一致保存在冰箱中，样品从0天处理计算一直到11天处理，测定，所以原孕马尿液中结合雌激素成分出现含量降低情况，故本次测定结果与第0天测定结果有很大的差异，马尿含量降低原先含量的一半左右，由于样品本身含量较低造成平行测定样含量之间出现较大差异，尤其是17α-双氢马烯雌酮含量rsd值达到13.1，但每个平行样之间其他两种成分含量差异不大，rsd值为7左右。

表12第11天样品处理测定结果

由表10～12可知，孕马尿hplc测定前，孕马尿样品通过酸碱处理后可以去掉孕马尿中含有的大量碳酸盐，大大提高检测效率，得以解决孕马尿hplc测定结合雌激素含量时所遇到的，每次测定不到30个样品，柱压升高，柱效降低等诸多问题，而且初步考察该方法的测定结果稳定性，对孕马尿中结合雌激素含量影响等因素，结果显示该方法处理后测定结果和孕马尿用水稀释(两种方法稀释倍数相同)后测定结果高度一致，不存在测定结果不稳定情况，而且从hplc图谱峰形来看，酸碱处理方法处理的样品hplc图谱峰形比水稀释直接测定样品峰形好，减少杂质峰干扰情况，故可以将此方法作为hplc测定孕马尿中结合雌激素成分的首选方法，并该做方法学验证实验，进一步确定该方法的可行性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。