1.一种孕马尿中结合雌激素含量的测定方法,其特征在于,包括以下步骤:
将孕马尿与无机酸混合进行前处理,然后用碱性物质调节ph至7.0~8.0,得到供试品溶液;
将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测,以保留时间定性,以标准方程计算得到结合雌激素的含量,所述标准方程是以结合雌激素的浓度为自变量、峰面积为因变量的方程;所述结合雌激素包括雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-双氢马烯雌酮硫酸钠中的一种或多种;
所述高效液相色谱的色谱条件为:
色谱柱:c18柱;
色谱柱规格:250mm×4.6mm,5μm;
流动相:包括a相和b相,其中a相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液,所述a相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/l,ph值为3.5;所述a相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1;b相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液,所述b相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/l,ph值为3.5;所述b相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7;
流动相洗脱程序为:0~18min,a相体积分数由70%逐渐降低为67%;18~23min,a相体积分数由67%逐渐降低为20%;23~28min,a相体积分数由20%逐渐升高为70%;28~35min,a相体积分数稳定在70%;
流速:1.0ml/min;
柱温:40℃;
检测波长:205nm;
进样量:20μl;
不同结合雌激素在同一色谱条件下的不同保留时间处出峰。
2.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述无机酸为盐酸溶液,所述盐酸溶液的浓度为0.1~3mol/l。
3.根据权利要求2所述的测定方法,其特征在于,所述孕马尿与无机酸的体积比为1:1~20:1。
4.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述碱性物质为naoh水溶液,所述naoh水溶液的浓度为0.1~3mol/l。
5.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述调节ph至7.0~8.0后还包括用0.22μm过滤膜过滤两次后,取续滤液作为所述供试品溶液。
6.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述孕马尿离心处理后再与无机酸混合,所述离心处理的时间为10~30min,转速为4000~6000转/分。
7.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述标准方程的测定包括以下步骤:
分别配制17α-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠的二级标准品待测溶液;
分别将所述二级标准品待测溶液进行高效液相色谱检测,分别得到二级标准品的色谱图;
所述高效液相色谱的色谱条件为:
色谱柱:c18柱;
色谱柱规格:250mm×4.6mm,5μm;
流动相:包括a相和b相,其中a相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液,所述a相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/l,ph值为3.5;所述a相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1;b相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液,所述b相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/l,ph值为3.5;所述b相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7;
流动相洗脱程序为:0~18min,a相体积分数由70%逐渐降低为67%;18~23min,a相体积分数由67%逐渐降低为20%;23~28min,a相体积分数由20%逐渐升高为70%;28~35min,a相体积分数稳定在70%;
流速:1.0ml/min;
柱温:40℃;
检测波长:205nm;
进样量:20μl;
根据所述二级标准品的色谱图,分别以17α-双氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠的浓度为自变量、峰面积为因变量,得到标准方程。
8.根据权利要求7所述的测定方法,其特征在于,所述二级标准品待测溶液的溶剂均为甲醇-水的混合液,所述混合液中甲醇与水的体积比为1:1,所述混合液的ph值为9.0。
9.根据权利要求8所述的测定方法,其特征在于,用tris缓冲溶液将所述混合液的ph值调节为9.0。