鉴别蛋白质中的游离巯基的方法与流程

文档序号:26309115发布日期:2021-08-17 13:48阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种鉴别蛋白质药物产品中的游离巯基的方法,其包括:

用第一标记物标记包含蛋白质药物产品的样品,所述第一标记物包含硫氢基反应性碘代乙酰基基团、ms中性间隔臂和具有独特报告子离子质量的第一ms/ms报告子;

移除过量的第一标记物;

使所述样品变性和还原;

用第二标记物标记所述样品,所述第二标记物包含硫氢基反应性碘代乙酰基基团、ms中性间隔臂和具有独特报告子离子质量的第二ms/ms报告子;

将所述样品用酶消化;

使用uplc-ms2系统分析所述样品,所述系统包括表面带电杂化颗粒柱和甲酸缓冲液流动相;以及

对所述第一ms/ms报告子和所述第二ms/ms报告子进行定量,其中所述第一ms/ms报告子的量与所述蛋白质药物产品中的游离巯基的量相关,而所述第二ms/ms报告子的量与所述蛋白质药物产品中的结合巯基的量相关。

2.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一ms/ms报告子的质量为128,并且所述第二ms/ms报告子的质量为131。

3.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一标记物和所述第二标记物选自

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述方法提供对igg分子中所有32个半胱氨酸残基的完全覆盖。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述方法覆盖igg分子中的重链和轻链上的16个半胱氨酸残基。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述方法覆盖igg分子的每条轻链上的5个半胱氨酸残基。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述方法覆盖igg分子的每条重链上的11个半胱氨酸残基。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中设定阈值为5%-6%的游离巯基,并且其中低于所述阈值的结果不显示出二硫键断裂的可能性。

9.一种鉴别蛋白质药物产品中的二硫键异质性的方法,其包括以下步骤:

用第一标记物标记包含蛋白质药物产品的样品,所述第一标记物包含硫氢基反应性碘代乙酰基基团、ms中性间隔臂和具有独特报告子离子质量的第一ms/ms报告子;

移除过量的第一标记物;

使所述样品变性和还原;

用第二标记物标记所述样品,所述第二标记物包含硫氢基反应性碘代乙酰基基团、ms中性间隔臂和具有独特报告子离子质量的第二ms/ms报告子;

将所述样品用酶消化;

使用uplc-ms2系统分析所述样品,所述系统包括表面带电杂化颗粒柱和甲酸缓冲液流动相;以及

对所述第一ms/ms报告子和所述第二ms/ms报告子进行定量,其中所述第一ms/ms报告子的量与所述蛋白质药物产品中的游离巯基的量相关,而所述第二ms/ms报告子的量与所述蛋白质药物产品中的结合巯基的量相关,其中检测到的游离巯基表明所述蛋白质药物产品具有二硫键异质性。

10.根据权利要求9所述的方法,其中所述第一标记物和所述第二标记物选自

11.根据权利要求9或10中任一项所述的方法,其中所述方法提供对igg分子中所有32个半胱氨酸残基的完全覆盖。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法,其中所述方法覆盖igg分子中的重链和轻链上的16个半胱氨酸残基。

13.根据权利要求9-11中任一项所述的方法,其中所述方法覆盖igg分子的每条轻链上的5个半胱氨酸残基。

14.根据权利要求9-11中任一项所述的方法,其中所述方法覆盖igg分子的每条重链上的11个半胱氨酸残基。

15.一种选择蛋白质药物产品的方法,其包括以下步骤:

用第一标记物标记包含蛋白质药物产品的样品,所述第一标记物包含硫氢基反应性碘代乙酰基基团、ms中性间隔臂和具有独特报告子离子质量的第一ms/ms报告子;

移除过量的第一标记物;

使所述样品变性和还原;

用第二标记物标记所述样品,所述第二标记物包含硫氢基反应性碘代乙酰基基团、ms中性间隔臂和具有独特报告子离子质量的第二ms/ms报告子;

将所述样品用酶消化;

使用uplc-ms2系统分析所述样品,所述系统包括表面带电杂化颗粒柱和甲酸缓冲液流动相;

对所述第一ms/ms报告子和所述第二ms/ms报告子进行定量,其中所述第一ms/ms报告子的量与所述蛋白质药物产品中的游离巯基的量相关,而所述第二ms/ms报告子的量与所述蛋白质药物产品中的结合巯基的量相关;以及

如果所述蛋白质产品具有极少游离巯基或不具有游离巯基,则选择所述蛋白质产品。

16.根据权利要求15所述的方法,其中所述选择的蛋白质药物产物在igg分子中含有少于5个游离巯基、少于4个游离巯基、少于3个游离巯基或少于2个游离巯基。

17.根据权利要求16所述的方法,其中所述游离巯基是在igg分子的轻链中。

18.根据权利要求16所述的方法,其中所述游离巯基是在igg分子的重链中。

19.根据权利要求16所述的方法,其中至少一个游离巯基在igg分子的轻链中,并且至少一个游离巯基在igg分子的重链中。

20.一种药物组合物,其包含在权利要求15-20中任一项中选择的蛋白质产品。


技术总结
提供了用于鉴别蛋白质中的游离巯基的组合物和方法。一种示例性方法用鉴别游离巯基的标签和鉴别原生二硫键的标签标记肽并使用靶向MS2分析所述标签。在一个实施方案中,所述方法提供对IgG分子中所有32个半胱氨酸残基的完全覆盖。在其他实施方案中,所述方法覆盖IgG分子中的重链和轻链上的16个半胱氨酸残基。在另一个实施方案中,所述方法覆盖IgG分子的每条轻链上的5个半胱氨酸残基。在另一个实施方案中,所述方法覆盖IgG分子的每条重链上的11个半胱氨酸残基。

技术研发人员:S·Y·伊;D·布拉姆霍尔;H·邱
受保护的技术使用者:瑞泽恩制药公司
技术研发日:2020.01.16
技术公布日:2021.08.17
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