测定实验对象组的制作方法

本申请是申请号为201480012135.8的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2013年1月3日提交的美国临时申请号61/748,626的权益，所述申请的完整内容通过引用并入本文。发明领域本申请涉及用于使用电化学发光技术检测细胞因子的试剂盒。发明背景细胞因子是介导急性和慢性炎症反应的可溶性因子，并且参与从伤口愈合到自身免疫性疾病的许多生理事件。它们是细胞介导的和体液免疫应答的重要调节剂，并且它们的差异表达已经与广泛范围的免疫病症相关。它们在各种细胞类型上起作用，对增殖、分化和成熟具有刺激或抑制作用。因此，测量任何生物系统中的仅单一细胞因子的水平仅提供了关于全身水平的响应的部分信息。细胞因子水平的综合测试通常目标在于测量大组细胞因子的浓度，以获得潜在生理学的更好的理解。酶联免疫吸附测定(elisa)是用于定量分泌的细胞因子的最常用且报道的方法。然而，elisa只可以在个别测定孔中检测每个反应一种分析物。这导致高试剂成本，过量的技术员时间，并且需要使用大样品体积来生成每个结果。经由强大的多重测定在相同样品中同时检测和定量许多细胞因子的能力将降低成本且改善效率。多重技术相比于常规测定方法的优点包括同时的分析物检测、减少的试剂处理、高测定通量和减少的样品和试剂量。发明概述本发明提供了用于分析细胞因子实验对象组的试剂盒，其包含：i.(a)多孔测定板，其包含多个孔，每个孔包含十个离散的结合域，针对以下人分析物的捕获抗体结合至所述结合域：ifn-γ、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10、il-12p70、il-13、tnfα；(b)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，对于所述人分析物特异性的标记的检测抗体的集合；和(c)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，校准蛋白的集合。ii.(a)多孔测定板，其包含多个孔，每个孔包含十个离散的结合域，针对以下人分析物的捕获抗体结合至所述结合域：gm-csf、il-1α、il-5、il-7、il-12/il-23p40、il-15、il-16、il-17a、tnf-β、vegf-a；(b)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，对于所述人分析物特异性的标记的检测抗体的集合；和(c)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，校准蛋白的集合。iii.(a)多孔测定板，其包含多个孔，每个孔包含十个离散的结合域，针对以下人分析物的捕获抗体结合至所述结合域：嗜酸细胞活化趋化因子、mip-α、嗜酸细胞活化趋化因子-3、tarc、ip-10、mip-1β、il-8、mcp-1、mdc、mcp-4；(b)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，对于所述人分析物特异性的标记的检测抗体的集合；和(c)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，校准蛋白的集合；iv.(a)多孔测定板，其包含多个孔，每个孔包含十个离散的结合域，针对以下大鼠分析物的捕获抗体结合至所述结合域：ifn-γ、il-2、il-4、il-1β、il-5、il-6、kc/gro、il-10、il-13、tnf-α；(b)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，对于所述人分析物特异性的标记的检测抗体的集合；和(c)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，校准蛋白的集合；或v.(a)多孔测定板，其包含多个孔，每个孔包含十个离散的结合域，针对以下小鼠分析物的捕获抗体结合至所述结合域：ifn-γ、il-1-β、il-2、il-4、il-5、il-6、kc/gro、il-10、il-12p70、tnf-α；(b)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，对于所述人分析物特异性的标记的检测抗体的集合；和(c)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，校准蛋白的集合。还提供了制造试剂盒或一批试剂盒(诸如本文所述的那些)的方法，其包括：(a)使对于所述人分析物特异性的检测抗体的初步集合进行cief、dls和experion；(b)基于所述cief、dls和experion测试从所述检测抗体的初步集合选择合格的检测抗体；(c)使对于所述人分析物特异性的捕获抗体的初步集合进行cief、dls和experion；(d)基于所述cief、dls和experion测试从所述捕获抗体的初步集合选择合格的捕获抗体。在一个优选实施方案中，一批试剂盒使用该方案制造，并且满足以下规格中的一个或多个：(a)≤10％的平均板内cv；(b)≤13％的最大板内cv；(c)≤25％的平均均匀度度量(uniformitymetric)；(d)≤37％的最大均匀度度量；(e)≤18％的板内平均值的cv；(f)>1500的信号下限；和(g)<106的信号上限。在一个优选实施方案中，本发明提供了用于分析两个或更多个细胞因子实验对象组的试剂盒，其包含：(a)两个或更多个多孔测定板，每个包含多个孔，每个孔包含十个离散的结合域，针对分析物的集合的捕获抗体结合至所述结合域，其中所述分析物的集合选自：(i)人分析物：ifn-γ、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10、il-12p70、il-13和tnfα；(ii)人分析物：gm-csf、il-1α、il-5、il-7、il-12/il-23p40、il-15、il-16、il-17a、tnf-β和vegf-a；(iii)人分析物：嗜酸细胞活化趋化因子、mip-1α、嗜酸细胞活化趋化因子-3、tarc、ip-10、mip-1β、il-8、mcp-1、mdc和mcp-4；(iv)大鼠分析物：ifn-γ、il-2、il-4、il-1β、il-5、il-6、kc/gro、il-10、il-13和tnf-α；或(v)小鼠分析物：ifn-γ、il-1-β、il-2、il-4、il-5、il-6、kc/gro、il-10、il-12p70和tnf-α；(b)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，对于所述分析物特异性的标记的检测抗体的集合；和(c)在一个或多个小瓶、容器或隔室中，校准蛋白的集合。本发明的一个额外实施方案是10点96孔多孔板，其中每个板包括板顶部、板底部、板顶部和底部x和y轴，且每个孔包含斑点图案，其中所述板满足以下规格：δx≤0.2mm，δy≤0.2mm，和α≤0.1°，其中(a)δx是沿着所述板的x轴的斑点图案的中心和孔的中心之间的差值(difference)；(b)δy是沿着所述板的y轴的斑点图案的中心和孔的中心之间的差值；且(c)α是板底部的x轴和板顶部的x轴之间的逆时针角。此外，本发明考虑10点96孔多孔板，其中每个板包含板顶部、板底部，且每个孔包含斑点图案，其中所述板满足以下规格：(a)3.8904-3.9004英寸的长度范围；(b)2.4736-2.4836英寸的宽度范围；和(c)0.3513-0.3573英寸的孔与孔间距。附图简述图1(a)-(c)说明多孔板的孔中的10点图案(小图(a))，其在96孔10点板中的放置(图(b))，和使用多孔测定板诸如本文所述的那些进行的免疫测定的原理。图2(a)-(e)是五个细胞因子实验对象组中每个的标准曲线。图3(a)-(b)显示96孔多孔测定板的构型。发明详述除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对象。通过实例的方式，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。如本文所使用，术语“样品”意指任何生物流体、细胞、组织、器官或其组合或部分，其包括或可能包括目标疾病的生物标志物。例如，样品可以是通过活检获得的样本的组织切片，或置于或适于组织培养的细胞。样品进一步可以是亚细胞级分或提取物，或粗或基本上纯的核酸分子或蛋白制备物。在一个实施方案中，在本发明的测定中分析的样品是血液、外周血单核细胞(pbmc)、分离的血细胞、血清和血浆。其他合适的样品包括活检组织、肠粘膜、唾液、脑脊髓液和尿液。本发明涉及用于分析细胞因子实验对象组的试剂盒。考虑至少五个测定实验对象组，并且每个试剂盒被配置以分析以下实验对象组之一：表1.细胞因子测定实验对象组所述试剂盒可以包括(a)多孔板上阵列的单一实验对象组，其被配置以用于电化学发光测定中，以及(b)相关耗材，例如，检测抗体、校准物和任选的稀释液和/或缓冲液。或者，可分开提供多孔板和相关的耗材。又进一步，试剂盒可以包括两个或更多个具有阵列在其上的实验对象组(即，实验对象组1-5)的多孔板，并且相关耗材可以在试剂盒中或单独提供。实验对象组1、2、4和5包括炎症相关的和/或生长因子生物标志物，其对于炎症反应、免疫和许多生物过程的调节是重要的。这些分泌的生物标志物可以在各种组织和体液中检测，并且它们的过表达或低表达可以表明机体的生物平衡的偏移。这些实验对象组还由许多th1/th2途径生物标志物组成。这些实验对象组中的生物标志物参与多种疾病，诸如类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、哮喘、动脉粥样硬化、过敏、系统性红斑狼疮、肥胖、癌症、抑郁、多发性硬化症、糖尿病、牛皮癣和克罗恩病等等。实验对象组3由八个cc趋化因子测定(mcp-1、mip-1a、mip-1b、嗜酸细胞活化趋化因子、mcp-4、tarc、mdc和嗜酸细胞活化趋化因子-3)和两个cxc趋化因子测定(il-8和ip-10)组成。趋化因子是具有约8-10kda的分子量的小趋化细胞因子，其能够诱导定向趋化作用。保守位置中的四个半胱氨酸残基引起其紧凑的三维结构。基于前两个半胱氨酸残基的间隔，它们被分为四个趋化因子的家族-cc趋化因子、cxc趋化因子、c趋化因子和cx3c趋化因子，其中c代表半胱氨酸，且x代表任何其他氨基酸。趋化因子通过活化特异性g蛋白偶联受体、引起炎性和非炎性细胞的迁移而发挥功能。促炎性趋化因子负责免疫细胞向感染部位的迁移，而稳态趋化因子负责目的在于组织维持和发育的细胞的迁移。趋化因子许多疾病相关。实验对象组1-5被配置在包括多个孔的多孔测定板中，每个孔具有阵列，所述阵列具有10个“斑点”或离散的结合域。10点孔的实例显示于图1(a)，并且该孔并入多孔板显示于图1(b)。将针对每种分析物的捕获抗体固定在孔中的结合域上，并且捕获抗体用于检测免疫测定中的目标分析物的存在，如图1(c)中所示。简而言之，将怀疑含有该分析物的样品添加至孔中，并且如果存在，分析物在指定结合域结合至捕获抗体。结合域上结合的分析物的存在通过添加标记的检测抗体进行检测。检测抗体也结合至分析物，在结合域上形成“夹心”复合物(捕获抗体-分析物-检测抗体)。实验对象组1-5中的每种分析物在该10点图案中的位置被鉴定在表2中。表2.每个实验对象组的斑点图案构型本文所述的多重免疫测定试剂盒允许使用者同时定量多种生物标志物。选择且优化实验对象组，使得个别测定在一起良好发挥功能。样品可以需要在测定之前进行稀释。针对给定实验对象组优化特定目标样品基质的样品稀释度，以尽可能减少样品基质效应，且尽可能增加实验对象组中的所有分析物都将在测定的动态范围内的可能性。在一个优选实施方案中，在至少一种样品类型中，实验对象组中的所有分析物用相同的样品稀释度进行分析。在另一个优选实施方案中，对于大多数样品类型，实验对象组中的所有分析物都使用相同的稀释度进行测量。对于给定实验对象组，调整检测抗体浓度和用于检测抗体的标记数/蛋白(l/p比)以使所有分析物的预期水平进入相同样品稀释度的可定量范围。如果想增加给定分析物的可定量范围的上端，则可以降低l/p和/或降低检测抗体浓度。另一方面，如果想增加可定量范围的下端，则可以增加l/p，可以增加检测抗体浓度，如果它不在饱和水平，和/或可以降低背景信号。选择用于测定实验对象组的校准标准品以提供实验对象组的建议样品稀释度的适当可定量范围。校准标准品具有已知浓度的实验对象组中的分析物中的一种或多种。未知样品中的分析物浓度通过与这些标准品比较来测定。在一个实施方案中，校准标准品包含通过测定实验对象组测量的不同分析物的混合物。优选地，选择组合校准物中的分析物水平，使得各分析物的测定信号是相当的，例如，在两倍、五倍或10倍内。在另一个实施方案中，校准标准品包括来自多个不同的测定实验对象组的分析物的混合物。校准曲线可以使用例如本领域已知的曲线拟合，诸如线性拟合，4-参数逻辑(4-pl)和5-参数(5-pl)拟合法拟合至用校准标准品测量的测定信号。使用此类拟合，未知样品中分析物的浓度可以通过将测量的测定信号反拟合至计算的拟合来测定。用校准标准品的测量也可用于测定测定特征，诸如检测限值(lod)、定量限值(loq)、动态范围和线性限值(lol)。试剂盒包括以下测定组分：经配置以进行本文所述的实验对象组之一的免疫测定的多孔测定板，实验对象组中的分析物的检测抗体的集合(其中该集合包含个别检测抗体和/或包含一种或多种个别检测抗体的掺合物的组合物)，和实验对象组中的分析物的校准物的集合(其中该集合包含个别校准蛋白组合物和/或包含一种或多种个别校准蛋白的掺合物的组合物)。该试剂盒还可以包括以下附加组分中的一种或多种：封闭缓冲液(用于在添加样品之前封闭测定板)，抗体稀释液(用于将储备检测抗体浓度稀释至工作浓度)，测定稀释液(用于稀释样品)，校准物稀释液(用于稀释或重构校准标准品)和阅读缓冲液(用于提供用于检测测定标记的适当环境，例如，通过ecl测量)。选择抗体和测定稀释液以降低背景，优化特异性信号，且减少测定干扰和基质效应。将校准稀释液进行优化，以得到最长的保质期且保留校准物活性。封闭缓冲液应当进行优化以降低背景。选择阅读缓冲液，以得到适当的灵敏度、可定量范围和最慢的解离速率。可以提供试剂盒的试剂组分作为液体试剂、冻干试剂或其组合(稀释或未稀释)，并且所述试剂盒包括用于在使用前适当制备试剂的说明书。在一个优选实施方案中，检测抗体的集合包括在试剂盒中，其包含液体形式的多种个别检测抗体组合物。而且，试剂盒中提供的校准物的集合优选包含校准蛋白的冻干掺合物。又进一步，所述试剂盒包括多孔测定板，所述多孔测定板已经用捕获抗体预包被，且暴露于稳定化处理，以确保固定化抗体的完整性和稳定性。作为多重实验对象组开发的部分，对测定进行优化，以减少校准物和检测抗体非特异性结合。在夹心免疫测定中，特异性主要来自捕获抗体结合。用于评估多重实验对象组的一些考虑包括：(a)将检测抗体与捕获抗体的非特异性结合降低至实验对象组中的测定的较低背景，且这可以通过调整检测抗体的浓度和l/p来实现；(b)检测抗体与实验对象组中的其他校准物的非特异性结合也是不期望的，应当尽可能减少；(c)实验对象组中的其他校准物和其他相关分析物的非特异性结合应当尽可能减少；如果存在校准物非特异性结合，则其可以减少实验对象组中的测定的总体特异性，并且其也可以得到不可靠的结果，因为将存在校准物竞争以结合捕获抗体。实验对象组中的不同测定对于最佳性能可需要不同的孵育时间和样品处理要求。因此，目标是选择对于实验对象组中的大多数测定优化的方案。测定方案的优化包括，但不限于，调整以下方案参数中的一种或多种：时机(每个步骤的孵育时间)、制备程序(校准物、样品、对照等)和洗涤步骤数。试剂盒中使用的试剂，例如，检测和捕获抗体和校准蛋白，优选进行分析测试，且满足或超过那些测试的规格。可以用于表征试剂盒材料的分析测试包括但不限于，cief、dls、还原和/或非还原experion、变性sds-page、非变性sds-page、sec-mals及其组合。在一个优选实施方案中，该材料通过cief、dls和还原和非还原experion表征。一个或多个额外测试，包括但不限于变性sds-page、非变性sds-page、sec-mals及其组合，也可用于表征材料。在一个优选实施方案中，该材料也进行功能测试，即目标分析物的结合测定，以及一种或多种表征测试，诸如上面列出的那些。如果该材料不满足或超过功能和/或表征测试的规格，则它们可以进行额外纯化步骤，且重新测试。下面描述这些测试中的每种和应用于进行这些测试的原料的分析的度量：毛细管等电聚焦(cief)是常用于分离肽和蛋白的技术，且其可用于检测聚集体。在cief分离过程中，毛细管填充有溶液中的样品，并且当应用电压时，离子迁移至它们变得中性的区域(ph＝pi)。毛细管的阳极端位于酸性溶液中(低ph)，而阴极端位于碱性溶液中(高ph)。等电点(pi)的化合物被“聚焦”为尖区段且留在其特异性区域，这允许基于分子电荷和等电点对其进行不同检测。各特异性抗体溶液将具有可以随着时间改变的指纹cief。当蛋白溶液变质时，蛋白的性质和电荷分布可以改变。因此，cief是评估蛋白溶液的相对纯度的特别有用的工具，并且它是表征本文所述的板和试剂盒中的抗体和校准物的优选方法。cief中使用的度量包括主峰的pi、溶液的pi范围和概况形状，且将这些测量中的每种与参考标准品的测量进行比较。动态光散射(dls)用于探测微粒材料在溶液中或悬浮液中的扩散。通过测定扩散速率(扩散系数)，可以在无需校准的情况下获得关于颗粒大小、大分子链的构型、溶液或悬浮液中的组分间的各种相互作用和甚至散射体的动力学的信息。在dls实验中，记录从介质中的散射体的散射光的波动(时间变化，通常为μs至ms时间尺度)，且相关延迟时间域中进行分析。像cief，各蛋白溶液将产生粒径的指纹dls，且其理想地适于检测聚集。所有igg，不管结合特异性，将表现出相同的dls粒径。用于使用dls分析蛋白溶液的度量包括百分比多分散性、百分比强度、百分比质量和蛋白峰的半径。在一个优选实施方案中，抗体溶液满足或超过以下dls规格中的一种或多种：(a)抗体峰的半径：4-8nm(抗体分子大小)；(b)抗体峰的多分散性：<40％(抗体分子的大小异质性的量度)；(c)抗体峰的强度：>50％(如果其他峰存在，则抗体峰是主要峰)；和(d)抗体峰的质量：>50％。还原和非还原凝胶电泳是本领域众所周知的技术。experiontm(bio-radlaboratories,inc.,www.bio-rad.com)自动电泳台通过将电泳、染色、脱色、条带检测和成像自动化和组合成单一步骤而在一个单元中进行所有基于凝胶的电泳的步骤。它可以用于测量纯度。优选地，抗体制剂通过experion大于50％纯，更优选大于75％纯，且最优选大于80％纯。应用于使用非还原experion的蛋白分析的度量包括蛋白的百分比总质量，并且对于还原experion，它们包括抗体溶液中的重和轻链的百分比总质量和重轻链比率。多角度光散射(mals)检测可用于独立(批次)模式以测量特异性或非特异性蛋白相互作用，以及结合分离系统诸如流场流分级法(flowfieldflowfractionation，fff)或大小排阻色谱(sec)。组合的sec-mals方法具有许多应用，诸如蛋白的寡聚状态的确认，蛋白聚集的定量，和蛋白缀合物化学计量的测定。优选地，该方法用于检测样品的组分的分子量。在一个优选实施方案中，测定在单一测定室中进行，诸如测定板的单一孔或作为筒(cartridge)的测定室的测定室。在一个优选实施方案中，本发明的试剂盒包括经配置以进行电化学发光测量的多孔测定板，如例如描述于us20040022677；us20050052646；us20050142033；us20040189311，其各自以其整体通过引用并入本文。测定板和板阅读器现在是市售的(和板和仪器，mesoscalediscovery,mesoscalediagnostics的一个部门,llc,gaithersburg,md.)。如本文所使用，一批试剂盒包含一组试剂盒，其包含满足试剂盒发布规格的集合的试剂盒组分。一批可包括至少10、至少100、至少500、至少1,000、至少5,000或至少10,000个试剂盒，且来自该批次的试剂盒的子集进行分析测试，以确保该批次满足或超过发布规格。在一个实施方案中，发布规格包括但不限于试剂盒处理、试剂稳定性和试剂盒组分储存条件规格。试剂盒处理规格包括最大总样品孵育时间和最大总时间来完成使用试剂盒的测定。试剂稳定性规格包括在指定储存温度的试剂盒的各试剂组分的最低稳定性。试剂盒储存条件规格包括试剂盒的所有组分的储存温度的范围，试剂盒的冷冻组分的最大储存温度，和试剂盒的非冷冻组分的最大储存温度。批次中的试剂盒的子集关于这些规格进行审查，子集的大小取决于批次大小。在一个优选实施方案中，对于多达300个试剂盒的批次，测试4-7个试剂盒的采样；对于300-950个试剂盒的批次，测试8-10个试剂盒的采样；对于大于950个试剂盒的批次，测试10-12个试剂盒的采样。可替代或额外，测试多达1-5％、优选多达1-3％且最优选多达2％的采样。此外，每批多孔测定板优选进行均匀度和功能测试。批次中的板的子集进行这些测试方法，且子集的大小取决于批次大小。在一个优选实施方案中，对于多达300个板的批次，测试4-7个板的采样；对于300-950个板的批次，测试8-10个板的采样；对于大于950个板的批次，测试10-12个板的采样。可替代或额外，测试多达1-5％、优选多达1-3％且最优选多达2％的采样。均匀度和功能测试规格在％cv(变异系数)的方面表示，所述变异系数是定义为测量集合(在这种情况下，从跨越板的结合域检测到的相对信号)除以该集合的平均值的标准偏差的无量纲数。一种类型的均匀度试验是蛋白a/g测试。蛋白a/g结合用于确认板内的所有结合域偶联至捕获抗体。蛋白a/g是组合蛋白a和蛋白g的igg结合域的重组融合蛋白，其结合人igg、以及iga、ige、igm和(在较小程度上)igd的所有子类。蛋白a/g也结合至小鼠igg的所有亚类，但不结合至小鼠iga、igm或血清白蛋白，使得其特别适合于检测小鼠单克隆igg抗体，而没有来自样品基质中可能存在的iga、igm和血清白蛋白的干扰。蛋白a/g可以用可检测部分，例如，荧光、化学发光或电化学发光标记，优选ecl标记进行标记，以便于检测。因此，如果捕获抗体粘附于孔的结合域，则其将结合至标记的蛋白a/g，且可以测量结合至跨过板的表面的捕获抗体的相对量。除了上述均匀度检测以外，可以计算批次内的板子集的均匀度度量以评价板内趋势。均匀度度量使用来自蛋白a/g的归一化信号的矩阵和/或其他均匀度或功能测试来计算。原始信号数据通过本领域已知的技术平滑，由此从原始数据减去噪音，且通过从最大信号减去经调整数据集合中的最小信号来计算均匀度度量。在一个优选实施方案中，批次中的板的子集进行蛋白a/g和功能测试，且该子集满足或超过以下规格：表3(a).板度量度量96孔多孔板的子集的优选规格平均板内cv≤10％最大板内cv≤13％平均均匀度≤25％最大均匀度≤37％板内平均值的cv≤18％信号，下限>1500信号，上限<10(6)。如wohlstadter等人的美国专利号7,842,246(其公开内容在此以其整体通过引用并入)中所公开，每个板由几个要素组成，例如，板顶部、板底部、孔、工作电极、计数器电极、参考电极、电介质材料、电连接和测定试剂。板的孔由板顶部中的孔/开口限定。可以将板底部手动或通过自动方式附着至板顶部，且板底部可以充当孔的底部。板可以具有任何数量的任何大小或形状、以任何图案或构型排列的孔，且它们可以由各种不同材料构成。本发明的优选实施方案使用板和孔的数量、大小、形状和构型的工业标准格式。标准格式的实例包括96、384、1536和9600孔板，其中所述孔被配置在二维阵列中。其他格式可以包括单一孔板(优选具有形成各孔内的斑点图案的多个阵列域)、2孔板、6孔板、24孔板和6144孔板。板的各孔包括不同密度的斑点图案，范围为孔内的一个斑点至2、4、7、9、10、16、25等个斑点。在一个优选实施方案中，用于本发明的试剂盒中的板包含10点96孔板(10-spot96-wellplates)。根据优选规格的集合组装各板。在一个优选实施方案中，板底部满足或超过以下规格：表3(b).板底规格参数96孔(圆孔)英寸规格长度范围(c至c)*3.8904-3.9004(a1-a12和h1-h12)**宽度范围(c至c)2.4736-2.4836(a1-a12和h1-h12)孔与孔间距0.3513-0.3573*c至c孔距离是板的最外孔之间斑点中心至斑点中心的距离。**如图3中所示，96孔多孔板包括以8x12阵列排列的孔的集合，其中板的短侧上的行通过a-h标识，且板的长侧上的列通过1-12标识。因此，可以测量行a1-a12中的长度和宽度，且与行h1-h12中的长度和宽度进行比较。在进一步优选的实施方案中，该板还满足或超过用于对准板的孔内的斑点图案的定义规格。这些规格包括三种参数：(a)δx，沿着板的x轴(列方向，长轴)的斑点图案的中心和孔的中心之间的差值；(b)δy，沿着板的y轴(行方向，短轴)的斑点图案的中心和孔的中心之间的差值；和(c)α，96孔板的板底部的长轴和板顶部的长轴之间的逆时针角。在一个优选实施方案中，板满足或超过以下规格：δx≤0.2mm，δy≤0.2mm，且α≤0.1°。以下非限制性实施例用来说明而不是限制本发明。实施例实施例1.试剂制备将所有试剂均置于室温，并且将稀释液在室温在水中解冻。(i)标准品的制备用于每个实验对象组的多分析物冻干的校准掺合物和所有稀释液获得自mesoscalediscovery(rockville,md)，在1ml稀释液中重构之后，其得到推荐的最高标准品。将冻干的校准物重构且保持在冰上。制备七(7)种标准溶液和零校准空白最多达4个重复，如下：(x)通过将1000μl稀释液添加至冻干的校准物小瓶而制备最高标准品。在使用前，将溶液通过涡旋混合，并且保持在湿冰上最少5分钟。(y)通过将75μl最高标准品转移至225μl稀释液而制备下一标准品。将溶液充分混合，并且该程序将4倍连续稀释重复额外5次，以生成7种标准品。(z)稀释液用作空白。一旦在稀释液2中重构至推荐的最高标准品，每个试剂盒的多分析物冻干的校准物在2-8℃稳定30天。(ii)样品收集和处理当制备血清时，允许样品在室温凝血两小时。肝素管中制备的血浆在样品解冻之后表现出额外的凝血。在等分之前，将血清和血浆两者以2000xg离心20分钟。对于无血清培养基，溶液中载体蛋白(例如，1％bsa)的存在用于防止分析物损失到实验室器皿。稀释具有极高水平的细胞因子的样品。将组织培养上清液样品在稀释液中稀释至少2倍。收集之后，将样品立即测试或将等分试样冷冻于≤20℃。在制备样品前，将样品以2000g离心三分钟以去除颗粒。(iii)样品的稀释对于人血清、血浆、csf、尿液和细胞培养上清液，在稀释液中进行最少2倍稀释。(iv)对照的制备在具有掺料的重组人分析物的非人动物基质中制备对照。将冻干的对照在250ul稀释液中重构，并且处理作为样品。一旦在250ul稀释液中重构，所述对照在2-8℃稳定30天。(v)检测抗体溶液的制备检测抗体作为50x储备溶液获得自mesoscalediscovery(rockville,md)，并且工作检测抗体溶液为1x。避免1x检测抗体溶液曝光，以防止升高的测定背景。一旦制备，将1x检测抗体溶液保持在暗处。对于1板的实验对象组1，组合以下：1.60ul50xsulfo-tagtm抗人ifn-γ抗体2.60ul50xsulfo-tag抗人il-1β抗体3.60ul50xsulfo-tag抗人il-2抗体4.60ul50xsulfo-tag抗人il-4抗体5.60ul50xsulfo-tag抗人il-6抗体6.60ul50xsulfo-tag抗人il-8抗体7.60ul50xsulfo-tag抗人il-10抗体8.60ul50xsulfo-tag抗人il-12p70抗体9.60ul50xsulfo-tag抗人il-13抗体10.60ul50xsulfo-tag抗人tnfα抗体11.2400ul来自mesoscalediscovery(rockville,md)的稀释液3对于1板的实验对象组2，组合以下：1.60ul50xsulfo-tag抗人gm-csf抗体2.60ul50xsulfo-tag抗人il-1α抗体3.60ul50xsulfo-tag抗人il-5抗体4.60ul50xsulfo-tag抗人il-7抗体5.60ul50xsulfo-tag抗人il-12/il-23p40抗体6.60ul50xsulfo-tag抗人il-15抗体7.60ul50xsulfo-tag抗人il-16抗体8.60ul50xsulfo-tag抗人il-17a抗体9.60ul50xsulfo-tag抗人tnfβ抗体10.60ul50xsulfo-tag抗人vegf-a抗体11.2400ul来自mesoscalediscovery(rockville,md)的稀释液3对于1板的实验对象组3，组合以下：1.60ul50xsulfo-tag抗人嗜酸细胞活化趋化因子抗体2.60ul50xsulfo-tag抗人mip-1β抗体3.60ul50xsulfo-tag抗人mcp-4抗体4.60ul50xsulfo-tag抗人嗜酸细胞活化趋化因子-3抗体5.60ul50xsulfo-tag抗人tarc抗体6.60ul50xsulfo-tag抗人ip-10抗体7.60ul50xsulfo-tag抗人mip-1α抗体8.60ul50xsulfo-tag抗人il-8抗体9.60ul50xsulfo-tag抗人mcp-1抗体10.60ul50xsulfo-tag抗人mdc抗体11.2400ul来自mesoscalediscovery(rockville,md)的稀释液3对于1板的实验对象组4，组合以下：1.60ul50xsulfo-tag抗大鼠ifn-γ抗体2.60ul50xsulfo-tag抗大鼠il-2抗体3.60ul50xsulfo-tag抗大鼠il-4抗体4.60ul50xsulfo-tag抗大鼠il-1β抗体5.60ul50xsulfo-tag抗大鼠il-5抗体6.60ul50xsulfo-tag抗大鼠ip-6抗体7.60ul50xsulfo-tag抗大鼠kc/gro抗体8.60ul50xsulfo-tag抗大鼠il-10抗体9.60ul50xsulfo-tag抗大鼠il-13抗体10.60ul50xsulfo-tag抗大鼠tnfα抗体11.2400ul来自mesoscalediscovery(rockville,md)的稀释液40对于1板的实验对象组5，组合以下：1.60ul50xsulfo-tag抗小鼠ifnγ抗体2.60ul50xsulfo-tag抗小鼠il-1β抗体3.60ul50xsulfo-tag抗小鼠il-2抗体4.60ul50xsulfo-tag抗小鼠il-4抗体5.60ul50xsulfo-tag抗小鼠il-5抗体6.60ul50xsulfo-tag抗小鼠ip-6抗体7.60ul50xsulfo-tag抗小鼠kc/gro抗体8.60ul50xsulfo-tag抗小鼠il-10抗体9.60ul50xsulfo-tag抗小鼠il-12p70抗体10.60ul50xsulfo-tag抗小鼠tnfα抗体11.2400ul来自mesoscalediscovery(rockville,md)的稀释液45(vi)阅读缓冲液的制备获得作为4x储备溶液的阅读缓冲液t(也可得自mesoscalediscovery)，并且工作溶液是2x。对于1个板，将等份(10ml)的阅读缓冲液t(4x)与去离子水(10ml)组合。预先制备阅读缓冲液的工作溶液，并且在室温储存在密封容器中(稳定最长达三年)。(vii)msd板的制备将多孔板(也可得自mesoscalediscovery)用捕获抗体预包被(图1)，并且暴露于专有稳定化处理，以确保固定化抗体的完整性和稳定性。板如交付时使用；不需要额外的制备(例如，预润湿)。实施例2.测定方案(i)每孔添加五十(50)ul稀释的样品(标准品、对照或未知物)。将板用粘性板密封物密封，并且在室温在剧烈振荡(300-1000rpm)的情况下孵育2小时。(ii)将板用150-300ul/孔的pbs-t洗涤3次。将二十五(25)ul检测抗体溶液添加至各孔。将板用粘性板密封物密封，并且在室温在剧烈振荡(300-1000rpm)的情况下孵育2小时。(iii)将板用150-300ul/孔的pbs-t洗涤3次。将一百五十(150)ul2x阅读缓冲液t(mesoscalediscovery,rockville,md)添加至各孔。在成像仪(mesoscalediscovery,rockville,md)中分析板。实施例3.实验对象组验证利用行业和法规指南执行测定开发和测定性能的评估。在产品开发过程中，开发且优化试剂盒组分和方案，以得到最佳产品性能。评估测定方案的稳健性，以检查所选孵育时间的界限。对于校准物、抗体和对照的加速稳定性研究在测定开发过程中进行，并且从制造日期起36个月在完整试剂盒上用实时稳定性研究增强。由两个独立分析师通过评估每个实验对象组的标准曲线和对照组(也获得自mesoscalediscovery,rockville,md)进行产品设计规格的验证，持续三天，总共八个板。每个板被认为作为一次运行。标准曲线数据的概述显示于图2(a)-(e)和表4-8。评估每个实验对象组的对照组的运行内和运行间的精密度和准确度，持续九次运行。对于每个批次验证精密度和准确度作为批次验证和质量控制释放的部分。关于天内和天间(intra-andinter-day)运行两者，对于对照，精密度的典型规格是小于20％的浓度cv。作为产品验证的部分，对于血清、肝素血浆、edta血浆、柠檬酸盐血浆、csf、尿液和/或细胞培养上清液中的掺料和回收率和稀释线性评估每个实验对象组的性能。在血清、肝素血浆、edta血浆、柠檬酸盐血浆、csf和尿液中测量天然人分析物水平。在血清、肝素血浆、edta血浆和尿液中测量天然大鼠和小鼠分析物水平。合并的人血液用不同的刺激物(lps和酵母聚糖和肽聚糖)在体外刺激，并且在刺激期结束时，分离血浆。此外，对于实验对象组1-3，thp-1细胞系用lps刺激，并且在刺激结束时，制备裂解物。新鲜分离的pbmc用不同的刺激剂处理，并且分离上清液。然后使用实验对象组1-3评估血浆、细胞裂解物和pbmc上清液的天然人分析物水平。对于实验对象组4，大鼠巨噬细胞(macrophase)细胞系nr8383用lps、pha和美洲商陆有丝分裂原(pwm)刺激，并且分离细胞裂解物和细胞培养物上清液。使用实验对象组4评估血浆、细胞裂解物和细胞培养物上清液的天然大鼠分析物水平。对于实验对象组5，raw细胞系用lps刺激，j774a.1细胞系用lps和pwm刺激，并且在刺激结束时，制备裂解物。然后使用实验对象组5评估血浆和细胞裂解物的天然小鼠分析物水平。图2(a)-(e)显示标准曲线图，其说明每个实验对象组(分别地，实验对象组1-5)的动态范围。表4.实验对象组1典型数据表5.实验对象组2典型数据表6.实验对象组3典型数据表7.实验对象组4典型数据表8.实验对象组5典型数据检测下限(llod)是基于高于背景(零校准物空白)的信号2.5标准偏差的计算浓度。表9-13中每个实验对象组中显示的llod基于8-9次运行计算。表9.实验对象组1llod表10.实验对象组2llod表11.实验对象组3llod表12.实验对象组4llod表13.实验对象组5llod在整个测定范围的水平，通过将校准物掺入非人动物基质(对于实验对象组1-3)、大鼠血清(对于实验对象组4)和小鼠血清(对于实验对象组5)而制备对照。经3天在3次运行使用最少3次重复测量分析物水平。平均运行内％cv是个别运行内的对照复制的平均％cv。运行间％cv是对照经所选数目运行的变异性。批次间％cv是对照经所选数目的试剂盒批次的变异性。表14.实验对象组1表15.实验对象组2表16.实验对象组3表17.实验对象组5为了评估实验对象组1-3中的线性度，在测试前，来自商业来源的正常个体人血清、edta血浆、肝素血浆、柠檬酸盐血浆和csf样品用重组校准物掺入且稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍和64倍。正常个体人尿液用重组校准物掺入且稀释2倍、4倍、8倍和16倍。在每个稀释度的回收百分率通过将稀释度调整的计算浓度除以预期浓度(即，在2倍稀释度(对于实验对象组1-2)和4倍稀释度(对于实验对象组3)的计算的稀释度调整的浓度)进行计算(参见以下方程)。为了评估实验对象组4中的线性度，在测试前，来自商业来源的正常大鼠血清、edta血浆、肝素血浆、柠檬酸盐血浆和尿液样品用重组校准物掺入且稀释4倍、8倍、16倍和32倍。在每个稀释度的回收百分率通过将稀释度调整的计算浓度除以预期浓度(即，在4倍稀释度的计算的稀释度调整的浓度)进行计算。为了评估实验对象组5中的线性度，在测试前，来自商业来源的正常小鼠血清、edta血浆、肝素血浆、柠檬酸盐血浆和尿液样品用重组校准物掺入且稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍和64倍。在每个稀释度的回收百分率通过将稀释度调整的计算浓度除以预期浓度(即，在2倍稀释度的计算的稀释度调整的浓度)进行计算。以下显示的平均回收率基于测定的定量范围内的样品。表18.实验对象组1表19.实验对象组2表20.实验对象组3表21.实验对象组4表22.实验对象组5评估在测定的整个可定量范围的不同样品类型的掺料和回收测量值。来自商业来源的多个体人血清、edta血浆、肝素血浆、柠檬酸盐血浆、尿液和/或csf样品和细胞培养物上清液用三种水平(高、中和低)的校准物掺入且随后稀释两倍。表23.实验对象组1表24.实验对象组2表25.实验对象组3表26.实验对象组4表27.实验对象组5为了评价个别测定的特异性，使用掺合的抗体与个别校准物以产生约100,000计数的信号的浓度运行每个实验对象组。表28.实验对象组1表29.实验对象组2表30.实验对象组3表31.实验对象组4表32.实验对象组5为了评价每种抗体的特异性，使用掺合的上面列出浓度的校准物和1x浓度的个别抗体运行每个实验对象组。表33.实验对象组1表34.实验对象组2表35.实验对象组3表36.实验对象组4表37.实验对象组5为了评估实验对象组1试剂盒测定针对其他生物标志物的特异性，使用掺合的抗体与个别重组人蛋白运行每个试剂盒。表38.实验对象组1表39.实验对象组2表40.实验对象组3为了评估多重对测定信号的影响，使用各试剂盒在个别测定(个别校准物和个体抗体)和多重测定(掺合的校准物和掺合的抗体)之间比较可定量范围中的标准品。下面显示个别和多重测定之间的计算的％信号差异。表41.实验对象组1表42.实验对象组2表43.实验对象组3表44.实验对象组4表45.实验对象组5设计试剂盒以尽可能降低受体和其他相关蛋白的干扰。对于每个实验对象组，稀释液中的多分析物校准物和正常人用三种不同浓度的受体和结合伴侣掺料。将回收的校准物浓度与未掺料的标准品和正常血清进行比较。将每个实验对象组中的所有测定针对从mesoscalediscovery(rockville,md)获得的参考校准物进行校准。针对msd参考校准物评估以下人分析物的nibsc/who标准品。为了将用实验对象组获得的样品值转化为近似nibsc/who浓度，将计算的样品值乘以浓度比。表46.实验对象组1表47.实验对象组2表48.实验对象组3表49.实验对象组5(a)正常样品测试来自商业来源的正常小鼠血清(对于实验对象组4，大鼠血清)、edta血浆、肝素血浆、柠檬酸盐血浆和尿液样品稀释2至4倍，并且用每个实验对象组测试。下面显示出每个样品组的浓度的中值和范围。针对样品稀释度校正浓度。表50.实验对象组1kd-不可检测的表51.实验对象组2表52.实验对象组3表53.实验对象组5(b)刺激的样品实验对象组1：新鲜收集的正常人全血与lps孵育，且同时与肽聚糖(pg)和酵母聚糖(zy)孵育不同的时间段，然后分离血浆。然后用实验对象组1测试这些样品。下面显示出各刺激模型的稀释度调整的浓度。表54.实验对象组1实验对象组2：新鲜收集的正常人全血在37℃与lps和pha孵育不同的时间段，然后分离血浆。用实验对象组2测试样品。表55.实验对象组2实验对象组3：新鲜收集的正常人全血在37℃与lps孵育不同的时间段，然后分离血浆。用实验对象组3测试样品。表56.实验对象组3实验对象组5：新鲜收集的正常合并的小鼠全血与lps孵育，且同时与肽聚糖(pg)和酵母聚糖(zy)孵育不同的时间段，分离血浆。在实验对象组5上运行样品。表57.实验对象组5对于实验对象组1-3，来自正常全血的新鲜分离的pbmc用lps、pha、pwm、cona刺激，并且用cd3和cd28抗体共刺激。然后用实验对象组1-3测试样品。显示出各刺激模型的以pg/ml计的稀释度调整的浓度。表58.实验对象组1表59.实验对象组2表60.实验对象组3对于实验对象组1-3，人急性单核细胞白血病细胞系(thp-1细胞系)用lps刺激六小时和16小时。然后分离上清液且用实验对象组1-3测试。下面显示出各样品的以pg/ml计的稀释度调整的浓度。表61.实验对象组1表62.实验对象组2表63.实验对象组3对于实验对象组5，小鼠单核细胞巨噬细胞细胞系(j774a.1)和小鼠白血病单核细胞巨噬细胞细胞系(raw264.7)用不同的刺激物刺激。j774a.1细胞系刺激持续四小时，而raw细胞系刺激持续六小时。收集裂解物且在实验对象组5上运行。浓度以pg/ml列出，且针对每孔50ug裂解物进行归一化。表64.实验对象组5以下校准物掺合物用于每个实验对象组中，如下：表65.实验对象组1表66.实验对象组2表67.实验对象组3表68.实验对象组4表69.实验对象组5以下抗体(捕获和检测)用于每个实验对象组中，如下：表70.实验对象组1表71.实验对象组2表72.实验对象组3表73.实验对象组4表74.实验对象组5＊＊＊本文引用各种出版物和测试方法，其公开内容以其整体通过引用并入本文，在通过引用并入本文和/或本文提及的本说明书和文献包括冲突的公开内容和/或不一致使用术语和/或并入/参考的文件使用或定义术语与本说明书中使用或定义它们不同的情况下，应当以本说明书为准。参考文献1.kauseml，等人.assessingimmunefunctionbyprofilingcytokinereleasefromstimulatedbloodleukocytesandtheriskofinfectioninrheumatoidarthritis.clin.immunol.2011；141(1)：67-72.2.holmesc，等人.proinfiammatorycytokines，sicknessbehavior，andalzheimerdisease.neurology2011；77：212-8.3.desaid，等人.cytokinesandcytokine-specifictherapyinasthma.ad.clin.chem.2012；57：57-97.4.guit，等人.diverserolesofmacrophagesinatherosclerosis：frominflammatorybiologytobiomarkerdiscovery.2012apr11；693083.5.islamsa，等人.tcellhomingtoepithelialbarriersinallergicdisease.nat.med.2012may4；18(5)：705-15.6.sudl，等人.rolesofpro-andanti-inflammatorycytokinesinthepathogenesisofsle.biomed.biotechnol.2012；3471417.lukensjr，等人.infiammasomeactivationinobesity-relatedinflammatorydiseaseandautoimmunity.discov.med.2011jul；12(62)：65-74.8.laouid，等人.tumor-associatedmacrophagesinbreastcancer：distinctsubsets，distinctfunctions.2011；55(7-9)：861-7.9.hallbergl，等人.exercise-inducedreleaseofcytokinesinpatientswithmajordepressivedisorder.j.affect.disord.2010；126(1)：262-267.10.oreja-guevarac，等人.th1/th2cytokineprofileinrelapsing-remittingmultiplesclerosispatientstreatedwithglatirameracetateornatalizumab.bmcneurol.2012sep.18；12(1)：95.11.svenssonj，等人.fewdifferencesincytokinesbetweenpatientsnewlydiagnosedwithtype1diabetesandtheirhealthysiblings.hum.immunol.2012aug17；s0198-8859(12)：00502-2.12.yehudah，等人.lsothiocyanatesinhibitpsoriasis-relatedproinflammatoryfactorsinhumanskin.inflamm.res.2012jul.；61(7)：735-42.13.gologans，等人.inflammatorygeneexpressionprofilesincrohn’sdiseaseandulcerativecolitis：acomparativeanalysisusingareversetranscriptasemultiplexligation-dependentprobeamplificationprotocol.j.crohnscolitis.2012sep24；s1873-9946(12)00393-5.14.kwanw，等人.bonemarrowtransplantationconfersmodestbenefitsinmousemodelsofhuntington’sdisease.j.neurosci.2012；32(1)：133-42.15.crottas，等人.hepatitiscvirionssubvertnaturalkillercellactivationtogenerateacytokineenvironmentpermissiveforinfection.j.hepatol.2010；52(2)：183-90.16.liux，等人.age-dependentneuroinflammatoryresponsesanddeficitsinlong-termpotentiationinthehippocampusduringsystemicinflammation.neuroscience.2012aug2；216；133-42.17.moonmh，等人.sphingosine-1-phosphateinhibitsinterleukin-1b-inducedinflammationinhumanarticularchondrocytes.int.j.mol.med.2012sep19；1135.18.mihaig，等人.circulatingcytokinesasmediatorsoffever.clin.infect.dis.2000；31：s178-s184.19.liaow，等人.il-2familycytokines：newinsightsintothecomplexrolesofil-2asabroadregulatorofthelpercelldifferentiation.cu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