N-糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量方法

n
‑
糖肽末端唾液酸
α
2,6和
α
2,3连接异构相对定量方法
技术领域
1.本发明属于分析化学技术领域，具体涉及n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量方法。


背景技术：

2.糖基化是生物体中广泛存在的一种重要蛋白质翻译后修饰(ptm)，对其蛋白质的化学和生物学特性有非常重要的影响。在人类糖蛋白上，唾液酸是一种酸性九碳糖家族，它通过α2,3
‑
或α2,6糖苷键连接在半乳糖(gal)残基上，它既可以作为附着蛋白的调节因子，也可以作为其他糖蛋白的识别靶点，从而调节各种生理和病理过程。唾液酸连接异构的分析方法多种多样，传统的谱学方法主要包括核磁共振法与红外吸收光谱法，这两类方法都通过不同连接唾液酸的谱学特征对其进行区分；
①
基于核磁共振法，可以通过对各元素的谱图进行解析，从而推断所分析糖链的完整结构；但其缺点在于，不能实现定量分析，同时需要相对大量且高纯度的样品；
②
糖链的红外吸收光谱则一般难以直接进行解析，需要与标准样品进行比对来确认其相应结构。这一方法虽然对样品量要求低，但对样品纯度却有较高的要求；同时，该方法对复杂糖链的结构解析较难。除此之外，凝集素也被用于唾液酸连接异构的分析。常用的凝集素中，怀槐凝集素(mal i)选择性识别α2,3
‑
连接唾液酸，而大豆凝集素(sna)选择性识别α2,6
‑
连接唾液酸。凝集素方法能够快捷用于分析某个样品中不同连接唾液酸的含量，并在样品间进行半定量对比，但无法精确获得位点、糖型及其结构信息，灵敏度方面表现也有所欠缺。尽管目前基于质谱(ms)的唾液酸化α2,3
‑
/α2,6
‑
连接n
‑
聚糖链异构的鉴定和定量已经得到了迅速发展，但n
‑
糖肽唾液酸α2,3/α2,6连接异构分离分析在技术上仍然非常具有挑战性。据报道，糖肽的唾液酸α2,3
‑
/α2,6
‑
连接异构在串级质谱中几种特征碎片的相对强度会存在差异，可通过计算来推算母离子中唾液酸的连接情况。但这一方法无法用于糖肽唾液酸α2,3
‑
/α2,6
‑
连接异构的定量分析。在高柱温情况下的pgc分离与反相色谱分离也能实现部分糖肽唾液酸连接异构的分离，但对于复杂的多糖肽样本分析受限。因此对于复杂n
‑
糖肽末端唾液酸α2,3/α2,6连接异构的相对定量分析缺乏方便、快捷、环境友好的定量方法。


技术实现要素：

3.本发明的目的是针对目前完整n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构体相对定量方法匮乏的现状，提供一种高通量、高效、准确的完整n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构体相对定量方法。
4.本发明使用液相分离和离子淌度质谱气相分级技术相结合的方法对完整n
‑
糖肽进行处理，对特定完整n
‑
糖肽离子在特定液相色谱保留时间与特定m/z下进行母离子的选择，并在质谱碰撞池内进行碰撞诱导解离（cid），采用无动态排除的数据依赖性质谱扫描模式进行质谱数据采集，实现对目标母离子的全采集；完成质谱数据采集后，将归属于该完整n
‑
糖肽的末端唾液酸α2,6和α2,3异构体b
3+
碎片的淌度到达时间分布（atds）面积进行比较，
从而实现不同完整n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构体的相对定量。具体步骤为：（1）将蛋白质样品的酶解富集后的n
‑
完整糖肽进行分离，以降低样本中n
‑
糖肽的复杂程度；这里，所述对n
‑
完整糖肽进行分离，可以采用反相液相色谱法、亲水液相色谱法、离子交换液相色谱法、疏水液相色谱法或毛细管电泳法进行分离；（2）将分离后的n
‑
糖肽进行质谱气相分离和质谱检测；其中，所述质谱气相分离，具体包括：1）母离子选择：将母离子在特定色谱分级保留时间，根据特定m/z下以
±
2da为窗口进行气相下的母离子的选择；2）质谱采集，针对上述选择的目标完整n
‑
糖肽母离子，以15～50ev碎裂能量进行碎裂，并将碎裂的全部离子再送入离子淌度质谱离子淌度漂移管进行分离分析，其中质谱的采集模式设置为hd
‑
ms/ms模式；最终对离子淌度分离后的碎片离子信号进行质谱数据的采集；这里，所述质谱检测采用的质谱仪为四极杆质谱仪、离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪与离子淌度质谱仪的一种或多种组合；（3）完成质谱数据采集后，将归属于同一完整n
‑
糖肽的末端唾液酸α2,6和α2,3异构体b
3+
碎片（[neuacα2
‑
3/α2
‑
6galβ1
‑
4glcnac]+, m/z 657.24）的淌度到达时间分布（atds）面积进行比较，得到α2,6和α2,3异构体b
3+
碎片的相对定量比值，从而实现了n
‑
完整糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构的相对定量。
[0005]
本发明提供的方法能够用于不同生理或病理状态下的不同生物体蛋白质样本，包括组织、细胞、不同亚细胞器、体液中完整n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量。
[0006]
与现有技术相比，本发明具有如下优点：（1）基于液相分离和质谱分级联用技术，实现n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构的相对定量。可以高通量、高效、准确的进行n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构的相对定量；（2）定量准确度高。基于目标完整n
‑
糖肽的碎片全淌度扫描，能够采集所有碎片离子的淌度分离，针对完整n
‑
糖肽的末端唾液酸α2,6和α2,3异构体b
3+
碎片（[neuacα2
‑
3/α2
‑
6galβ1
‑
4glcnac]+, m/z 657.24）的淌度到达时间分布（atds）进行定量分析；（3）环境优化，无需化学反应，具有更高的准确性。
附图说明
[0007]
图1为本发明基于液相分离和离子淌度质谱气相分级技术相结合，实现n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构连接的相对定量工作流程图。
[0008]
图2为本发明中不同比例标准n
‑
糖肽α2,3
‑
sgp和α2,6
‑
sgp对应的b
3+
碎片淌度分离后的淌度到达时间分布图。
[0009]
图3为本发明中标准n
‑
糖肽α2,3
‑
sgp和α2,6
‑
sgp的b3+碎片的淌度到达时间分布峰面积相对比与理论比例的关系图。
[0010]
图4为本发明中触珠蛋白n
‑
糖肽末端唾液酸α2,3和α2,6异构连接的综合表征。
具体实施方式
[0011]
实施例1：实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为分析纯。
[0012]
（1）标准n
‑
糖肽样品准备： 将末端唾液酸α2,6和α2,3连接的标准完整n
‑
糖肽（α2,6
‑
sgp和α2,3
‑
sgp）按照一定质量分别溶于0.1% tfa，获得最终浓度为8.7 μm的两种标准储备液。标准糖肽α2,6
‑
sgp和α2,3
‑
sgp以绝对浓度（87 nm）按照不同混合比例（0，0.1，0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1）进行混合，制备为分析样本。
[0013]
（2）混合标准糖肽的液相分离：在线 lc 采用 waters 公司 m
‑
class nano
‑
lc 系统：a 相为 0.1% fa 水溶液；b 相为 0.1 % tfa 的acn 溶液。n
‑
糖肽采用 on
‑
column 上样，上样流速为 300 nl/min，上样 4 min。随后进入分析柱分离，色谱柱采用15 cm c
18 柱 (nanoe mz pst csh130 c
18 1.7μ 75 μm
ꢀ×ꢀ
150 mm)。采用60min的梯度，从1%的b相开始，40min后从35%的b相开始，5min后增加到80%的b相，然后调整到1% b相。
[0014]
（3）质谱气相分级与质谱检测：标准糖肽α2,6
‑
sgp和α2,3
‑
sgp在保留时间为14.75～15.25min，在四极杆质谱中以分别以m/z 956.08（3+）和m/z1433.35（2+）两个通道进行母离子选择，选择范围
±
2da。根据不同碎裂能量（15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 和 50 ev）进行母离子的碰撞诱导解离（cid），产生的碎片在离子淌度池（im）中进行分离；随后进入质谱检测器中检测（lc
‑
cid
‑
im
‑
ms）。离子淌度质谱喷雾电压为 2.2 kv，锥孔电压为30 v，加热毛细管为 100 ℃，数据采用非数据依赖性模式hd
‑
ms/ms采集。淌度行波速度为 950 m/s，波高最大设定在 40 v，n2漂移气体流速为90 ml/min。数据采集一级扫描范围 100
‑
2000 m/z，分辨率 20 k，udmse 碎裂模式。 lockspray mass为 le (556.2771 da) 数据采集软件为 masslynx 4.1。
[0015]
如图2所示，α2,6
‑
sgp和α2,3
‑
sgp的α2,6和α2,3异构体b3+碎片（[neuacα2
‑
3/α2
‑
6galβ1
‑
4glcnac]+, m/z 657.24）的碰撞诱导截面分别是236
å2和246
ꢀå2，对应的到达时间分别是5.9 ms 和6.4 ms。不同比例获得的atd具有不同的分布趋势。
[0016]
（4）数据分析： 完成质谱数据采集后，用masslynx 4.1软件对保留时间相同、质荷比相同的α2,6
‑
sgp和α2,3
‑
sgp产生的α2,6和α2,3异构体b3+碎片（[neuacα2
‑
3/α2
‑
6galβ1
‑
4glcnac]+, m/z 657.24）提取其淌度到达时间分布图（atds），根据二者的淌度分离峰进行峰面积计算；随后将峰面积进行比较，得到α2,6和α2,3异构体b3+碎片的相对定量比值，该比值归属于α2,6
‑
sgp和α2,3
‑
sgp中所含α2,6和α2,3异构连接的相对比例。
[0017]
图3中经上述分析方法计算α2,3
‑
sgp与α2,6
‑
sgp混合末端唾液酸α2,6和α2,3异构连接实际比例与理论比例相一致。2
+
和3
+
电荷态sgp所产生的α2,6和α2,3异构体b3+碎片在进行末端唾液酸α2,6和α2,3异构连接相对定量中均具有较高的定量准确性，线性关系的r2值分别为0.992和0.997。因此本发明中以完整n
‑
糖肽含有末端唾液酸α2,6和α2,3异构体b
3+
碎片（[neuacα2
‑
3/α2
‑
6galβ1
‑
4glcnac]+, m/z 657.24）的淌度质谱分离分析实现完整n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构体的相对定量具有较高的准确性。
[0018]
实施例2：以血清中纯化的触珠蛋白（hp）为分析物，通过本发明建立的n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量方法，分析触珠蛋白含有的完整n
‑
糖肽末端唾液酸α2,3和α2,6异构连接的相对比例。
[0019]
（1）纯化血清触珠蛋白：血清样本在12000*g离心十分钟，随后使用hitrap柱子纯化。结合柱上的触珠蛋白用洗脱缓冲液(ph 3.0, 100 mm glycine, 0.5 m nacl)洗脱，后丙酮沉淀浓缩。
[0020]
（2）触珠蛋白的酶解和n
‑
糖肽纯化：取190μl浓度1mg/ml的触珠蛋白，加入10μl浓度为200mm二硫苏糖醇（dtt）溶液， 56 ℃下反应1h，进行蛋白质的变性和还原处理。随后加入10ul 400mm的碘乙酰胺溶液（iaa），室温下避光反应30 min进行蛋白质的烷基化处理。最后加入4μg胰蛋白酶进行蛋白质的酶解，在37 ℃酶解12小时后，加入4μg glu
‑
c消化继续酶解12 h。最终加入10μl甲酸溶液进行酶解反应的终止。
[0021]
（3）hilic富集n
‑
糖肽：首先用500μl平衡液（80% acn/0.1% tfa）平衡hilic柱3次；再溶于平衡液的触珠蛋白酶解肽段上样3次后，用平衡液洗涤富集糖肽的hilic柱3次；最后，用300μl 0.1% tfa的洗脱液洗脱富集在hilic上的n
‑
糖肽2次，合并洗脱液后真空离心干燥待用。
[0022]
（4）lc
‑
ms/ms分析：在线 lc 采用 waters 公司 m
‑
class nano
‑
lc 系统：a 相为 0.1 % fa 水溶液；b 相为 0.1 % tfa 的acn 溶液。完整n
‑
糖肽采用 on
‑
column 上样，上样流速为 0.3 μl/min，上样 4 min；随后进入分析柱分离，色谱柱采用15 cm c18 柱 (nanoe mz pst csh130 c18 1.7μ 75 μm x 150 mm)：采用60分钟的梯度，从1%的b相开始，40分钟后从35%的b相开始，5分钟后增加到80%的b相，然后调整到1% b相。
[0023]
（5）n
‑
糖肽数据检索：采用byonic
tm
软件(version 2.16.11, protein metrics, san carlos, ca)检索触珠蛋白序列(p00738)的原始数据文件，设定母离子和子离子的质量误差分别为20 ppm和0.05 da。零缺失的切割位点被trypsin/glu
‑
c消化。固定修饰为氨基甲酰化(c)，变量修饰为氧化(m)和去酰胺化(n)。结果在1% fdr下进行过滤，byonic评分>150的置信阈值下进行手工验证。检索出的高可信n
‑
糖肽用于本发明中的n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量研究。
[0024]
（6）n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量方法分析：选用lc
‑
ms/ms一致的色谱条件。如图1所示，在特定保留时间下，触珠蛋白的各完整n
‑
糖肽根据其m/z在四极杆中被分别选择并进行碰撞诱导解离（cid），母离子所产生的全部碎片在离子淌度池（im）中进行淌度分离，最终进入质谱检测器中检测并收集信号。喷雾电压为 2.2 kv，锥孔电压为30 v，加热毛细管为 100 ℃，数据采用非数据依赖性模式/数据依赖性采集。淌度行波速度为 950 m/s，波高最大设定在 40 v，n2漂移气体流速为90 ml/min。糖肽的 cid能量采用从 15～50 v的梯度能量。数据采集一级扫描范围 100～2000 m/z，分辨率 20k，hdms/ms扫描模式。lockspray mass为 le (556.2771 da) 数据采集软件为 masslynx 4.1。
[0025]
（7）利用masslyn 4.1 软件对各完整n
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糖肽的α2,6和α2,3异构体b3+碎片（[neuacα2
‑
3/α2
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6galβ1
‑
4glcnac]+, m/z 657.24）进行淌度到达时间分布的提取（atds）；并根据其α2,6和α2,3异构体b3+碎片的分布时间的峰面积相对比例，实现血清触珠蛋白中完整n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构连接的相对定量综合表征。如图4所示，本发明实现了血清触珠蛋白不同n糖基化位点中所含有的n
‑
糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构连接的相对定量。为后续触珠蛋白的医学诊断应用提供广阔的应用前景。