银杏叶滴丸中黄酮醇苷类成分含量测定方法与流程

1.本发明涉及中药含量测定分析方法，具体涉及银杏叶滴丸中黄酮醇苷类成分含量测定方法建立及11批银杏叶滴丸含量测定结果。


背景技术：

2.银杏叶滴丸收载于《中国药典》2020年版(第一部)，由银杏叶提取物与聚乙二醇4000加热溶化，混匀，滴入甲基硅油冷却剂中，除去表面油迹，或包薄膜衣制备而成，主要用于瘀血阻络引起的胸痹心痛、中风、半身不遂，舌强语謇；冠心病稳定性心绞痛、脑梗死见上述证候者。
3.黄酮醇苷类成分复杂，是银杏叶滴丸中主要的活性成分，现行标准中，采用水解测苷元法间接测定总黄酮醇苷的含量，但此方法无法鉴别出掺假的违法行为，因此，需要建立一种直接测定黄酮醇苷的方法，从原型黄酮醇苷的角度直接进行质量控制。


技术实现要素：

4.为了实现上述目的，本发明提供银杏叶滴丸黄酮醇苷类成分含量测定的建立方法，包括如下步骤：
5.(1)供试品溶液的制备：取银杏叶滴丸适量，研细，取粉末0.2g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40ml，超声处理40min(40khz,500w)，取出，冷却至室温，摇匀，13000rpm，离心10min，取上清液，即得。
6.(2)对照品溶液的制备：精密称取芦丁(rutin)、槲皮素
‑3‑
o
‑
葡萄糖基(1
‑
2)鼠李糖苷(quercetin
‑3‑
o
‑
glucosyl
‑
(1
‑
2)
‑
rhamnoside
7.，qgr)、山柰酚
‑3‑
o
‑
芸香糖苷(kaempferol
‑3‑
o
‑
rutinoside，k
‑3‑
r)、异鼠李素
‑3‑
o
‑
芸香糖苷(isorhamnetin
‑3‑
o
‑
rutinoside，i
‑3‑
r)、槲皮素
‑3‑
o
‑
2"
‑
(6"
‑
p
‑
香豆酰基)
‑
葡萄糖基
‑
鼠李糖苷(quercetin
‑3‑
o
‑
2"
‑
(6"
‑
p
‑
coumaroyl)
‑
glucosyl
‑
rhamnoside，qrcg)、山柰酚
‑3‑
o
‑
2"
‑
(6"
‑
p
‑
香豆酰基)
‑
葡萄糖基
‑
鼠李糖苷(kaempferol
‑3‑
o
‑
2"
‑
(6"
‑
p
‑
coumaroyl)
‑
glucosyl
‑
rhamnoside，krcg)6个标准品各5.26mg、4.46mg、5.45mg、5.22mg、4.82mg及4.66mg分别于2ml的容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，精密移取上述6个单标溶液各0.8ml作为混合标准品母液。
8.(3)色谱条件：色谱柱：agilent infinitylab poroshell 120ec
‑
c
18
(2.1
×
150mm,2.7μm)，流动相：以0.05％甲酸溶液为流动相a，以乙腈
‑
甲醇(7：3)为流动相b，梯度洗脱：0
‑
6min，16％b；6
‑
20min，16
‑
19％b；20
‑
21min，19
‑
20％b；21
‑
34min，20
‑
25％b；34
‑
35min，25
‑
27％b；35
‑
43min，27
‑
35％b；43
‑
47min，35
‑
38％b；47
‑
50min，38
‑
95％b；50
‑
53min，95％b；流速：0.3ml/min；进样量：2μl；柱温：40℃；检测波长：360nm。
9.(4)含量测定：将11批银杏叶滴丸分别按照上述步骤(1)制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，按照上述步骤(3)的色谱条件进行检测，分别记录保留时间和峰面积，采用标准曲线法计算待测成分百分含量。
10.本发明公开了一种直接测定银杏叶滴丸中6种黄酮醇苷类成分的方法，所述建立方法包括供试品溶液的制备、色谱条件的建立及测定，可以同时测定6个黄酮醇苷类成分的含量。
11.与现有技术相比，本发明的改进点在于：
12.1、直接测定原型黄酮醇苷成分的含量，在一定程度上可以减少加入廉价黄酮醇苷掺假的违法行为，可以更好的对银杏叶、银杏叶提取物及其制剂进行质量控制。
13.2、本方法具有精密度、稳定性、重复性及准确度好的优点，方法简单稳定。
附图说明
14.图1本发明实施例待测成分紫外光谱图
15.图2银杏叶滴丸对照品及样品图谱
16.图3本发明实施例采用三根不同的色谱柱的对比图。
17.图4本发明实施例采用不同水相体系的对比图。
18.图5本发明实施例采用不同比例有机相体系的对比图。
19.图6本发明实施例采用不同流速体系的对比图。
20.图7本发明实施例采用不同柱温体系的对比图。
21.图8银杏叶滴丸中待测成分标准曲线图。
22.图9 11批银杏叶滴丸中的6个黄酮醇苷化合物的百分含量。
23.其中，峰1：芦丁；峰2：槲皮素
‑3‑
o
‑
葡萄糖基(1
‑
2)鼠李糖苷；峰3：山柰酚
‑3‑
o
‑
芸香糖苷；峰4：异鼠李素
‑3‑
o
‑
芸香糖苷；峰5：槲皮素
‑3‑
o
‑
2"
‑
(6"
‑
p
‑
香豆酰基)
‑
葡萄糖基
‑
鼠李糖苷；峰6：山柰酚
‑3‑
o
‑
2"
‑
(6"
‑
p
‑
香豆酰基)
‑
葡萄糖基
‑
鼠李糖苷。
具体实施方式
24.以下结合实施例对本发明作进一步地说明，以便对本发明作更详细的了解。
25.实施例1
26.1实验材料
27.1.1样品信息
28.表1银杏叶滴丸样品信息(万邦德制药集团有限公司)
[0029][0030]
1.2实验仪器与试剂
[0031]
1.2.1实验仪器
[0032]
agilent 1260infinity ii高效液相色谱仪：包括泵：1260flexible pump；自动进样器：1260vialsample；色谱柱恒温箱：1260mct；1260dad hs检测器、milli
‑
q超纯水系统(bedford，usa)、5427r台式高速冷冻离心机(eppendorf，germany)、4℃低温冰箱(haier，china)、万分之一天平、十万分之一电子天平(sartorius，germany)、kh
‑
500db数控超声仪(昆山禾创超声仪器有限公司，china)
[0033]
1.2.2试剂
[0034]
芦丁(批号：must
‑
15091104，纯度：>98％)；异鼠李素
‑3‑
o
‑
芸香糖苷(批号：must
‑
17070407，纯度：>99.99％)、槲皮素
‑3‑
o
‑
2"
‑
(6"
‑
p
‑
香豆酰基)
‑
葡萄糖基
‑
鼠李糖苷(批号为：must
‑
17021001，纯度：>99.62％)、山柰酚
‑3‑
o
‑
2"
‑
(6"
‑
p
‑
香豆酰基)
‑
葡萄糖基
‑
鼠李糖苷(批号：must
‑
18041001，纯度：>99.50％)购自购自成都曼思特生物科技有限公司；山柰酚
‑3‑
o
‑
芸香糖苷(批号：ps0833
‑
0025，纯度：>98％)购自成都普思生物科技股份有限公司；槲皮素
‑3‑
o
‑
葡萄糖
‑1‑
2鼠李糖苷(批号：112043
‑
201901，纯度：>92.5％)购自中国食品药品检定研究院。
[0035]
乙腈(merck，美国)，甲醇(merck，美国)，甲酸(roe，美国)，超纯水经milli
‑
q水纯化系统(bedford，美国)纯化得到。
[0036]
2方法与结果
[0037]
2.1供试品溶液制备方法的考察
[0038]
2.1.1提取方法的考察
[0039]
考察不同提取方式的提取效果(超声40min与回流120min)，由表2可知，两者所得峰面积(mau)无明显差异，考虑到后续大批量提取，选择超声提取。
[0040]
表2滴丸不同提取方式考察结果(n＝3)
[0041][0042]
2.1.2提取溶剂的考察
[0043]
考察了水、乙醇、甲醇、75％甲醇及50％甲醇的提取效果，由表3可得，甲醇所得各峰的峰面积(mau)最高，故将甲醇作为提取溶剂。
[0044]
表3滴丸不同提取溶剂考察结果(n＝3)
[0045][0046]
2.1.3提取时间的考察
[0047]
分别考察了超声处理20min、40min及60min的提取效果，如表4所示，提取40min提取效率最高。
[0048]
表4滴丸不同提取时间考察结果(n＝3)
[0049][0050]
2.1.4料液比的考察
[0051]
考察提取体积分别为10ml、20ml及40ml的提取效果，如表5所示，不同提取体积所得各峰峰面积无明显差异，40ml所得峰面积最高，选择40ml为提取体积。
[0052]
表5滴丸不同提取体积考察结果(n＝3)
[0053][0054]
2.1.5提取完全率的考察
[0055]
为防止一次提取不完全，对提取完全率进行考察，将提取一次后的溶液过滤，滤渣连同滤纸同法进行两次提取，分别进样分析，计算一次提取完全率，由表6可得，一次提取后，各待测化合物的提取完全率均>92％，表明提取一次即可。
[0056]
表6提取完全率考察结果(n＝3)
[0057][0058]
综上所述：样品制备方法为取样品0.2g，精密称定，加入甲醇40ml，超声处理40min，提取一次即可。
[0059]
2.2色谱方法的优化和选择
[0060]
2.2.1检测波长选择及峰纯度检查
[0061]
对样品及标品进行全波长扫描，由不同成分的紫外吸收图可知(图1)，大多待测化合物在350
‑
370nm处有特定紫外吸收，参考文献及各国标准，选择适合的检测波长为360nm，供试品溶液及对照品溶液所得色谱图如图2，使用对照品对待测色谱峰进行峰纯度检查，经比对，各待测成分与对照品紫外吸收光谱图均一致，无干扰。
[0062]
2.2.2考察不同色谱柱的分离效果
[0063]
考察了三根不同的色谱柱(柱a：agilent infinitylab poroshell 120ec
‑
c
18
(2.1
×
150mm，2.7μm)；柱b：agilent zorbax sb c
18
(2.1
×
100mm，1.8μm)；柱c：agilent zorbax eclipse plus c
18
(2.1
×
150mm，1.8μm))的分离效果及对相对保留时间的影响，由图3可知，柱a所得色谱图峰形较好，且峰3(k
‑3‑
r)分离度较高，最终选择此色谱柱进行后续分析。
[0064]
2.2.3考察流动相的组成
[0065]
考察乙腈
‑
甲醇(7
‑
3)
‑
水溶液(a)、乙腈
‑
甲醇(7
‑
3)
‑
0.05％磷酸溶液(b)、乙腈
‑
甲醇(7
‑
3)
‑
0.05％甲酸溶液(c)、乙腈
‑
甲醇(7
‑
3)
‑
0.1％甲酸溶液(d)、乙腈
‑
甲醇(6
‑
4)
‑
0.05％甲酸溶液(e)、乙腈
‑
甲醇(8
‑
2)
‑
0.05％甲酸溶液(f)和乙腈
‑
0.05％甲酸溶液(g)7种流动相，所得色谱图为图4及图5。如图可得，加酸之后，峰形变好，磷酸与甲酸所得色谱图相似，且甲酸的浓度不影响分离效果与峰形，出于对色谱柱及仪器的保护，选择0.05％甲酸溶液为水相；流动相e、f及g所得色谱图中峰4(i
‑3‑
r)均有小峰包裹，因此综合考虑，选择乙腈
‑
甲醇(7
‑
3)为有机相。
[0066]
2.2.4考察流速
[0067]
考察了不同流速(0.2ml/min、0.3ml/min及0.4ml/min)条件下的分离效果，结果如图6，流速为0.3ml/min时，峰3(k
‑3‑
r)及峰4(i
‑3‑
r)分离度达到要求。
[0068]
2.2.5考察柱温
[0069]
考察了不同柱温(35℃、40℃及45℃)条件下的分离效果，结果见图7，柱温为40℃时，峰1(rutin)及峰6(krcg)的分离度达到要求。
[0070]
综上所述：色谱柱采用：agilent infinitylab poroshell 120ec
‑
c
18
(2.1
×
150mm,2.7μm)，以0.05％甲酸溶液为流动相a，以乙腈
‑
甲醇(7：3)为流动相b，梯度洗脱流速：0.3ml/min；柱温：40℃；检测波长：360nm。
[0071]
2.3方法学考察
[0072]
2.3.1线性、检测限及定量限
[0073]
线性关系考察：取混合标准品母液，分别精密移取0.9ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.3ml、0.1ml、0.05ml、0.01ml于1ml容量瓶中，精密移取0.01ml于5ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀即得，按色谱条件进样分析，以浓度(μg/ml)为横坐标(x)，峰面积(mau)为纵坐标(y)，绘制标准曲线。结果如表7及图8所示，6个化合物的相关系数r2>0.9998，表明在线性范围内，浓度和峰面积之间的线性较好。
[0074]
检测限(lod)及定量限(loq)：将对照品溶液用甲醇稀释至约3倍信噪比的浓度(s/n＝3)，即为检测限(lod)；稀释约10倍信噪比的浓度(s/n＝10)即为定量限(loq)，结果如表7所示。
[0075]
表7滴丸中待测成分标准曲线、检测限和定量限
[0076][0077]
2.3.2精密度考察
[0078]
2.3.2.1日内精密度
[0079]
取对照品溶液，于同一天内连续进样6针，记录响应峰面积，计算其rsd值，由表8可知，各峰峰面积rsd值均小于1％，表明仪器的日内精密度良好。
[0080]
表8滴丸中待测成分日内精密度考察结果
[0081][0082]
2.3.2.1日间精密度
[0083]
取对照品溶液，每天进样3针，连续3天，记录峰面积，计算其rsd值，由表9可知，各峰峰面积rsd值均小于1％，表明仪器的日间精密度良好。
[0084]
表9滴丸中待测成分日间精密度考察结果
[0085][0086]
2.3.3重复性考察
[0087]
取同一批银杏叶滴丸粉末(编号2)0.2g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按色谱条件进样分析，记录其峰面积，计算各峰百分含量及rsd值，结果见表10，结果表明，rsd值均小于2％，该方法重复性较好。
[0088]
表10滴丸中待测成分重复性考察结果(n＝6，百分含量％)
[0089][0090]
2.3.4稳定性考察
[0091]
取银杏叶滴丸粉末(编号2)0.2g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h分别进样分析，记录各待测成分的峰面积，计算其百分含量及rsd值，结果见表11，由表可知，rsd值均小于3％，表明稳定性良好。
[0092]
表11滴丸中待测成分稳定性考察结果(n＝6，百分含量％)
[0093]
[0094]
3.3.5准确度考察
[0095]
准确度采用加样回收率实验考察，取已知含量的银杏叶滴丸粉末(编号2)0.1g，精密称定，平行6份，分别加入与样品中待测化合物含量相近的对照品溶液，制备样品溶液，进样分析，记录峰面积，按下式计算待测物的回收率，结果见表12～表17。由结果可知，6种黄酮醇苷所测得回收率均符合药典要求，表明本方法准确度良好。
[0096]
回收率(％)＝[(测得量
‑
含有量)/加入量]
×
100％
[0097]
表12滴丸中rutin加样回收率考察结果(n＝6)
[0098][0099]
表13滴丸中qgr加样回收率考察结果(n＝6)
[0100][0101]
表14滴丸中k
‑3‑
r加样回收率考察结果(n＝6)
[0102][0103]
表15滴丸中i
‑3‑
r加样回收率考察结果(n＝6)
[0104]
[0105]
表16滴丸中krcg加样回收率考察结果(n＝6)
[0106][0107]
表17滴丸中qrcg加样回收率考察结果(n＝6)
[0108][0109]
2.4样品分析
[0110]
制备样品溶液，按照色谱条件对11批银杏叶滴丸样品进行分析，记录各待测成分峰面积，使用标准曲线法计算其百分含量。结果见图9及表18。
[0111]
表18 11批银杏叶滴丸样品含量测定结果(％,n＝2)
[0112][0113]
由上述结果可知，11批滴丸中6个黄酮醇苷中含量较高的是两个香豆酰基类成分：槲皮素
‑3‑
o
‑
2"
‑
(6"
‑
p
‑
香豆酰基)
‑
葡萄糖基
‑
鼠李糖苷(qrcg)及山柰酚
‑3‑
o
‑
2"
‑
(6"
‑
p
‑
香豆酰基)
‑
葡萄糖基
‑
鼠李糖苷(krcg)，含量范围分别为0.77％～0.82％及0.57％～0.63％；含量最低的是：槲皮素
‑3‑
o
‑
葡萄糖基(1
‑
2)鼠李糖苷(qgr)，其含量范围为0.19％～0.20％；6个黄酮醇苷总含量范围在2.57％～2.75％。