一种氟伐替尼中硝基苯类基因毒性杂质的分离检测方法与流程

本发明属于药物分析化学领域，具体涉及氟伐替尼中硝基苯类基因毒性杂质（即3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚）的分离检测方法。

背景技术：

1、氟伐替尼是一种处于研究阶段的小分子多靶点激酶抑制剂，氟伐替尼可作用于血管内皮细胞生长因子受体（vegfr1/2/3），纤维细胞生长因子受体（fgfr1/2/3/4）和转染期间重新排列（ret）等多个靶点，具有靶向治疗肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，hcc）的潜力。其药理作用机制是通过抑制 vegf/vegfr、fgf/fgfr信号通路，从而控制肿瘤细胞生长、存活、增殖和迁移。hcc是最常见的恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、进展快、复发早和预后差的临床特点；我国原发性肝癌发病率一直居高不下，约90%是肝细胞肝癌（hcc），严重威胁着国人生命健康。氟伐替尼是一种临床急需的药物，用法用量：需根据i期临床和ii期临床试验结果确定。

2、                     氟伐替尼

3、                              3,4-二氟-2-氯-硝基苯（i）                  2-氟-3-氯-4-硝基苯酚（ii）

4、杂质2-氟-3-氯-4-硝基苯酚（ii）为氟伐替尼合成路线的起始原料之一，杂质3,4-二氟-2-氯-硝基苯（i）为2-氟-3-氯-4-硝基苯酚的起始原料，这2种杂质结构中均带有硝基苯类警示结构，且软件预测结果表明均具有一定的基因毒性风险。作为起始物料及起始物料引入的杂质，在氟伐替尼产品中具有残留的可能性，需要作为基因毒性杂质在药物成品中进行严格控制。

5、根据ich m7的要求，计算得到氟伐替尼中杂质3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚的限度均为500ppm，为了严格控制氟伐替尼产品的质量，将限度收严为100ppm，采用常规的hplc-uv方法对氟伐替尼中的基因毒性杂质3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚进行定量分析难度较大。因此，需开发有效的分析方法用于氟伐替尼原料和制剂中基因毒性杂质3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯含量的检测。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种氟伐替尼中硝基苯类基因毒性杂质的分离检测方法，该方法对基因毒性杂质3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚能进行有效的分离和定量检测，专属性好、灵敏度高，对氟伐替尼原料药和制剂的质量控制具有重要的意义。

2、为实现本发明的目的，提供如下实施方案。

3、在一实施方案中，本发明的一种氟伐替尼中硝基苯类基因毒性杂质的分离检测方法，所述杂质包括3,4-二氟-2-氯-硝基苯和/或2-氟-3-氯-4-硝基苯酚，该方法为液相色谱法，具体的：1）色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，2）流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为磷酸-水溶液，所述流动相b为乙腈，3）采用梯度洗脱法； 其中，所述流动相a，磷酸-水的体积比为（0.05~0.2）:（99.95~99.8）。

4、上述本发明的方法，具体过程包含以下步骤：

5、a)配制对照品溶液：取3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚适量，精密称定，加有机溶剂溶解并用稀释剂稀释，得到对照品溶液；

6、b)配制供试品溶液：取供试品适量，加稀释剂溶解，得到供试品溶液；

7、c)设置色谱条件：流动相的流速为0.7~0.9ml/min，检测波长为200~400nm，色谱柱的柱温为25℃~40℃，进样量为5μl~100μl；

8、d)取相同体积的步骤a）的对照品溶液、b）的供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，使用外标法计算得到3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚的含量。

9、上述本发明的方法，步骤a）、b）中所述有机溶剂选自乙腈、甲醇，所述稀释剂为乙腈-水溶液，乙腈-水的体积比为（20~80）:（80~20）。

10、在一具体实施方案中，本发明的一种氟伐替尼中硝基苯类基因毒性杂质的分离检测方法，所述杂质包括3,4-二氟-2-氯-硝基苯和/或2-氟-3-氯-4-硝基苯酚，

11、具体包含以下过程：

12、1）配制对照品溶液：取3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚适量，精密称定，加有机溶剂溶解并稀释配制储备液，取储备液进一步用稀释剂稀释制成每1ml中约含3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚各0.3μg的溶液，作为对照品溶液；

13、2）配制供试品溶液：取供试品适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含供试品3mg的溶液，作为供试品溶液；

14、3）设置色谱条件：流动相的流速为0.7~0.9ml/min；检测波长为200~400nm；色谱柱的柱温为25℃~40℃；进样量为5μl~100μl；

15、4）将步骤1）和2）的对照品溶液和供试品溶液分别注入液相色谱仪，其特征在于：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为磷酸-水溶液，磷酸-水的体积比为（0.05~0.2）:（99.95~99.8），优选为0.1:99.9，所述流动相b为乙腈，采用梯度洗脱法。

16、上述本发明的方法，优选的，所述梯度洗脱法，其流动相梯度变化如下：

17、

18、在上述具体实施方案中，

19、步骤1）中所述有机溶剂选自乙腈、甲醇，所述稀释剂为乙腈-水溶液，乙腈-水的体积比为（20~80）:（80~20），优选体积比为50:50。在上述具体实施方案中，优选的，流动相的流速为0.8ml/min，流动相a中磷酸含量为为0.1%；

20、在上述具体实施方案中，优选的，检测波长为210nm；

21、在上述具体实施方案中，优选的，色谱柱的柱温为40℃；

22、在上述具体实施方案中，优选的，进样量为20μl。

23、本发明的方法的有益效果：本发明采用简单实用的hplc-uv的检测方法，实现了氟伐替尼中基因毒性杂质3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚的有效分离和定量检测。该方法可以将氟伐替尼中的2个硝基苯类基因毒性杂质（3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚）与氟伐替尼中的其他有关物质有效分离，能准确测定3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚的含量，其专属性好、灵敏度高，且简单、快速，从而可以准确控制氟伐替尼的质量。

24、特别是，本发明的方法采用常规十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，采用此色谱柱不仅成本低，又能够有效的分离检测氟伐替尼的基因毒性杂质3,4-二氟-2-氯-硝基苯和2-氟-3-氯-4-硝基苯酚，同时灵敏度也能达到相应要求；流动相由常规的0.1%磷酸水溶液和乙腈组成，配制简单，且成本低廉；梯度运行时间短，检测速度快，分析效率得到了有效提升。