一种协同催化电化学传感器的制备方法及其应用

1.本发明属于电化学传感分析技术领域，具体涉及一种协同催化电化学传感器的制备方法及其应用。


背景技术：

2.重金属因其难降解、易富集、毒性强等特点，对生态环境、食品安全造成了严重影响，并以慢性中毒的方式危害人体健康。其中，铅是一种对人体危害极大的有毒重金属，为此，世界卫生组织明确规定了铅在水体、农产品等不同基质中的限量标准。传统的重金属检测方法有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、x射线荧光光谱法等，虽然这些方法准确度高，但存在设备昂贵、操作复杂、耗时长等不足。近年来，发展的荧光、电化学、拉曼等传感分析方法由于简便快速、特异性强等优点受到了普遍关注；其中，电化学传感方法因其易便携化、灵敏度高等优势，在重金属检测中发挥着越来越重要的作用。
3.在电化学传感体系构建过程中，传感界面的催化性能对提高检测灵敏度起着重要作用。近来，纳米酶，尤其是金属-有机框架材料(mof)由于催化活性高、稳定性好、易合成等优点，在传感分析中常被用作模拟酶实现电化学信号放大。然而，在该应用中存在两方面的不足，一方面，mof需借助生物分子固定到传感界面，由于生物分子的不良导电性能，在一定程度上影响了mof的电催化性能；另一方面，选用四甲基联苯胺-过氧化氢(tmb-h2o2)体系为催化底液，利用单一mof自身的过氧化氢模拟酶催化特性实现仿生催化，其催化的效率相对较低。为了进一步实现痕量甚至超痕量重金属的检测，研发模拟酶与其它材料协同催化的电化学传感界面尤为重要。例如，现有的文献报道了通过静电吸附作用，将mof与贵金属(如纳米金aunps)结合制得了复合材料用作荧光、拉曼、电化学传感基底。然而，由于mof的不良导电性，其在电化学传感界面的修饰在较大程度上阻碍了传感界面的电子传递，进而影响检测灵敏度。因此，充分发挥mof与贵金属的协同催化作用，进而选择高效电活性物质提高传感界面的电子传输能力是建立高灵敏电化学传感分析方法亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明设计合成了mof模拟酶与aunps修饰的电化学传感界面，并向其中加入电活性物质亚甲基蓝(mb)，通过溶剂热法制备了mof，进而将其与aunps直接混合制备aunp/mof复合材料；基于aunp/mof的协同催化作用和mb优异的电子传输能力，获得放大的电流信号；同时，利用核酸适配体对铅离子的特异识别作用，构建了电化学dna传感器，实现了复杂基质样品中pb
2+
的灵敏、准确检测。
5.为了实现以上目的，本发明的具体步骤如下：
6.(1)称取2-氨基对苯二甲酸(nh
2-bdc)和六水三氯化铁(fecl3·
6h2o)，加入二甲基甲酰胺(dmf)中，超声混匀后放入聚四氟乙烯反应釜中，然后再加入乙酸，在油浴锅中进行反应后，经冷却、离心、洗涤、干燥，得到的产物即为mil-88；
7.(2)aunps溶液的制备：
8.将氯金酸加入到纯水中，得到氯金酸水溶液，加热至沸腾后，加入柠檬酸三钠溶液，当溶液颜色变为酒红色后，停止搅拌加热，冷却至室温后，离心收集沉淀物复溶于水中，得到aunps溶液；
9.(3)aunp/mof协同催化材料的制备：
10.称取步骤(1)制备的mil-88加到去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液；然后在混合溶液中加入步骤(2)制备的aunps溶液，搅拌后经离心、洗涤得到aunp/mof材料，将其溶于tris-hcl中得到aunp/mof溶液；
11.(4)电化学dna传感器的建立包括以下步骤：
12.将步骤(3)所制备的aunp/mof溶液滴于玻碳电极表面，经室温干燥后，滴加目标dna(即携带电活性物质亚甲基蓝(mb)的dna，购买自上海生工生物工程有限公司)，于室温条件下反应后，得到电化学dna传感器。
13.进一步的，步骤(1)中所述2-氨基对苯二甲酸、六水三氯化铁、二甲基甲酰胺和乙酸的用量关系为0.05～5g：0.1～5g：5～50ml：0.1～10ml；所述聚四氟乙烯的体积为10～80ml。
14.进一步的，步骤(1)中所述超声时间为2～10min；所述油浴锅中反应温度为100～150℃，反应时间为2～10h；所述干燥温度为50～100℃，干燥时间为12～48h。
15.进一步的，步骤(2)中所述氯金酸水溶液的质量浓度为1～5％，柠檬酸三钠溶液的质量浓度范围为1～4％；所述氯金酸水溶液与柠檬酸三钠溶液的用量关系为50～150μl：2～10ml。
16.进一步的，步骤(2)中所述aunps溶液的质量浓度范围为8～12％。
17.进一步的，步骤(3)中所述mil-88与去离子水的用量关系为4～10mg：4～10ml；所述混合溶液与aunps溶液的用量关系为1～10ml：2～10ml；所述搅拌的时间为1～8h；所述aunp/mof溶液浓度为1mg/ml。
18.进一步的，步骤(4)中所述aunp/mof溶液与目标dna滴加的体积比为1～2：1～3。
19.进一步的，所述aunp/mof溶液的用量为4～10μl。
20.进一步的，步骤(4)中所述室温条件下反应的时间为1～5h。
21.进一步的，步骤(4)中所述目标dna浓度范围为20～40μm；其中目标dna即为携带电活性物质mb的dna；序列为：
[0022]5’‑
mb-gcatctctctctgaagtagcgccgccgtccgtatagggtatacggraggaag agagagatgcaaaa-sh-(ch2)6-3’。
[0023]
基于协同催化电化学传感器用于pb
2+
的检测，具体步骤如下：
[0024]
(1)配制一系列浓度梯度的pb
2+
标准溶液，然后将上述方法制备的电化学dna传感器浸入到pb
2+
标准溶液中，一个电化学dna传感器对应一个浓度的pb
2+
标准溶液；在chi630d电化学工作站上检测记录电流减少值，建立电化学信号和pb
2+
溶液浓度的标准线性关系：δi＝f*k+g，其中δi为电流减少值，k为pb
2+
浓度的对数，f和g为系数和常数；
[0025]
(2)待测样品中pb
2+
浓度的检测：
[0026]
将电化学dna传感器置于pb
2+
的待测溶液中，在电化学工作站上检测记录电流减少值；并将其代入步骤(1)建立的标准线性关系中，得到待测溶液中pb
2+
的浓度，实现对pb
2+
的高灵敏检测。
[0027]
进一步的，步骤(1)中所述pb
2+
溶液浓度范围为0～10-3
m。
[0028]
本发明的有益效果：
[0029]
(1)本发明所述传感界面材料制备简单、催化活性强，既发挥了高稳定性mof与aunps的协同催化作用，又结合了mb优异的电子传输能力，能够满足特定条件下重金属高灵敏电化学检测的需求。
[0030]
(2)本发明所述的aunp/mof材料无需生物材料等中间介质即能直接固定于电极表面，缩短了与电极表面间的距离，提高了电子传递效率，进一步提高了重金属检测的灵敏度。
[0031]
(3)本发明所述的aunp/mof材料可回收性高，能多次循环使用，节约经济成本。
[0032]
(4)本发明所述的电化学dna传感器利用核酸适配体特异识别复杂基质中的重金属，提高了传感体系的抗干扰能力，增强了重金属检测的准确性。
附图说明
[0033]
图1是mil-88的扫描电镜图。
[0034]
图2是mil-88的透射电镜图。
[0035]
图3是mil-88的傅里叶红外光谱仪图。
[0036]
图4是aunps/mil-88的扫描电镜图。
[0037]
图5是aunps/mil-88的透射电镜图。
[0038]
图6是不同修饰电极在含mb的tris-hcl中dpv的响应电流图。
[0039]
图7是pb
2+
检测的标准曲线。
具体实施方式
[0040]
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：实施例在本发明的技术方案为前提下进行，给出了详细实施步骤和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0041]
本发明所使用的目标dna购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0042]
实施例1：
[0043]
(1)称取0.0650g nh
2-bdc和0.1320g fecl3·
6h2o，加入10ml dmf，超声混匀2min后，加到30ml的聚四氟乙烯反应釜中，再加入0.1ml乙酸，将反应釜放入油浴锅中110℃反应3h；反应结束，待反应釜自然冷却至室温后，通过离心的产物依次使用dmf、乙醇和纯水洗涤，最后使用真空干燥箱在50℃条件下干燥12h，得到红褐色的产物，即为mil-88；
[0044]
(2)aunps的制备：
[0045]
将氯金酸加到纯水中，配制质量浓度为2.5％的氯金酸水溶液；之后利用电炉进行加热，搅拌至沸腾后，缓慢加入2ml质量浓度为1.5％柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌，当溶液颜色变为酒红色后，停止搅拌加热，冷却至室温后，离心、将所得沉淀物复溶于水中得到质量浓度为9％的aunps溶液；
[0046]
(3)aunp/mof协同催化材料的制备：
[0047]
称取4mg mil-88加到4ml去离子水中，混匀后得到混合溶液；然后取3ml混合溶液直接加到5ml aunps溶液中并磁力搅拌3h，搅拌结束后，离心收集沉淀物用超纯水洗涤三次，即得到aunps/mil-88协同催化材料，随后加入tris-hcl(ph 7.0)中，得到1mg/ml的
aunps/mil-88溶液，待用；
[0048]
(4)电化学dna传感器的构建：
[0049]
取4μl浓度为1mg/ml的aunps/mil-88溶液滴于玻碳电极表面，并于室温下自然干燥，随后滴加6μl 20μm的目标dna于电极表面；在37℃下孵育2h后，用去离子水洗去未与aunps/mil-88结合的dna，得到电化学dna传感器。
[0050]
pb
2+
检测方法：
[0051]
(1)配制一系列浓度梯度的pb
2+
标准溶液，浓度分别为0、10-12
、10-11
、10-10
、10-9
、10-8
、10-7
m。然后将电化学dna传感器浸入pb
2+
标准溶液中，一个电化学dna传感器对应一个浓度的pb
2+
标准溶液；在chi630d电化学工作站上检测记录电流减少值，建立电化学信号和pb
2+
溶液浓度的标准线性关系：δi＝3.30423*logc
pb2+
+0.818(r2＝0.9987)；
[0052]
(2)实际样品检测：
[0053]
本发明进一步提供了上述传感界面协同催化的高灵敏电化学分析方法在茶叶中pb
2+
检测的应用。
[0054]
首先对5种不同茶叶进行预处理，在微波消解仪中进行消解，之后在控温电热板上加热，随后过滤，定容；分别取6ml上述样品溶液，作为待测溶液，然后将电化学dna传感器置于待测溶液中，记录相应的电流减少值，代入步骤(1)建立的标准线性关系中，得到待测溶液中pb
2+
的浓度；并通过加标回收法对龙井茶叶样品进行回收实验，得到回收率在98.7％～101.6％之间。
[0055]
将该电化学分析方法的检测结果与高效液相色谱法(hplc)相比，如表1所示，本发明制备的传感器线性范围宽，回收率也高于hplc法，说明本发明能够满足pb
2+
准确、灵敏检测的需求，用于实际样品中pb
2+
的检测是可行的。
[0056]
表1此电化学分析法与hplc检测比较
[0057][0058]
本发明灵敏度高、特异性强的原因在于：(1)本发明所整合的传感界面具有协同催化反应物、双重放大电信号的作用，它既利用了aunps的强电子传输特性，又结合了mof的高效仿生催化优势；基于aunps和mof对mb的协同催化作用，实现了电化学信号放大，从而提高了电化学检测的灵敏度。(2)本发明所制备的aunp/mof复合材料无需生物材料等中间介质即能直接固定于电极表面，减小了与电极表面的间隙，提高了传感界面的电子传输能力，进一步提升了检测灵敏度。(3)利用dna对pb
2+
的特异识别作用构建电化学传感器，抗干扰能力强，避免了复杂基质样品中其它组分的干扰，从而获得更准确的分析结果。
[0059]
图1是mil-88的扫描电镜图，从图中可以看出，mil-88呈规则的正八面体，平均粒
径约为300nm，且背景中无其它杂质，表明所制备的mil-88结构稳定、大小均匀。结合图2(mil-88的透射电镜图，100nm)也进一步证明了mil-88的成功合成。
[0060]
图3为mil-88的傅里叶红外光谱仪图，图中显示，mil-88在770cm-1
处存在c-h的伸缩振动，在1434cm-1
处存在-o-c-o-的伸缩振动，在3327cm-1
、3453cm-1
处存在nh2的伸缩振动。
[0061]
图4和图5分别是aunps/mil-88的扫描电镜图和透射电镜图，从图中可以看出，当mil-88修饰aunps时，大量aunps均匀附着在mil-88的表面，证实了aunps/mil-88的成功制备。
[0062]
实施例2：
[0063]
(1)称取1.1238g nh
2-bdc和2.2420g fecl3·
6h2o，加入30ml dmf，超声混匀5min后，加到50ml的聚四氟乙烯反应釜中，再加入2ml乙酸，将反应釜放入油浴锅中130℃反应4h，反应结束，待反应釜自然冷却至室温后，通过离心的产物依次使用dmf、乙醇和纯水洗涤，最后使用真空干燥箱70℃干燥24h，得到红褐色产物，即为mil-88。
[0064]
(2)aunps的制备：
[0065]
将氯金酸加到纯水中，配制质量浓度为1.5％的氯金酸水溶液；之后利用电炉进行加热，搅拌至沸腾后，缓慢加入4ml质量浓度为2.5％柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌，当溶液颜色变为酒红色后，停止搅拌加热，冷却至室温后，离心、将所得沉淀物复溶于水中得到质量浓度为9.5％的aunps溶液。
[0066]
(3)aunp/mof协同催化材料的制备：
[0067]
称取6mg mil-88加到6ml去离子水中，混匀后取5ml上述溶液直接加到6ml aunps溶液中并磁力搅拌5h，搅拌结束后，离心并用超纯水洗涤三次得到aunps/mil-88协同催化材料，随后储存于tris-hcl(ph 7.0)中，得到1mg/ml aunps/mil-88溶液，待用。
[0068]
(4)电化学dna传感器的构建：
[0069]
取6μl 1.0mg/ml的aunps/mil-88溶液滴于玻碳电极表面，并于室温下自然干燥，随后在电极表面滴加8μl 30μm的目标dna；37℃下孵育3h后，用去离子水洗去未与aunps/mil-88结合的dna，得到电化学dna传感器。
[0070]
pb
2+
检测方法：
[0071]
(1)配制一系列不同浓度的pb
2+
标准溶液，浓度分别为0、10-13
、10-12
、10-11
、10-10
、10-9
、10-8
m。然后将电化学dna传感器浸入pb
2+
标准溶液中，一个电化学dna传感器对应一个浓度的pb
2+
标准溶液；在chi630d电化学工作站上检测记录电流减少值，建立电化学信号和pb
2+
溶液浓度的标准线性关系：δi＝2.1297*logc
pb2+
+0.673(r2＝0.9963)
[0072]
(2)实际样品检测：
[0073]
本发明进一步提供了上述传感界面协同催化的高灵敏电化学分析方法在土壤中pb
2+
检测的应用。
[0074]
首先对土壤进行预处理，在微波消解仪中进行消解，之后在控温电热板上加热，随后过滤，定容。分别取6ml上述样品溶液，作为待测溶液，然后将电化学dna传感器置于待测溶液中，记录相应的电流减少值，代入步骤(1)建立的标准线性关系中，得到待测溶液中pb
2+
的浓度；并通过加标回收法对土壤样品进行回收实验，得到回收率在98.4％～102.1％之间。
[0075]
图6是不同修饰电极在含mb的tris-hcl中差分脉冲伏安法(dpv)的响应电流图。其中，aunps/mil-88/gce是指取4μl 1.0mg/ml的aunps/mil-88溶液滴于玻碳电极表面，并于室温下自然干燥后得到的电极；mil-88/gce是指取4μl 1.0mg/ml的mil-88溶液滴于玻碳电极表面，并于室温下自然干燥后得到的电极；bare gce是指不加任何修饰材料的裸电极。如图所示，裸电极在-0.23v处出现较小的氧化峰，电流大小为3.905μa，当在电极表面修饰mil-88时，电流信号达到了7.072μa，电流信号明显增强，表明mil-88对mb有高效的电催化活性；aunps/mil-88修饰电极对mb的响应电流增加到8.488μa，这主要是由于mb优异的电子传输能力及其与mil-88对mb的协同催化作用。
[0076]
实施例3：
[0077]
(1)称取4.2050g nh
2-bdc和3.1276g fecl3·
6h2o，加入40ml dmf，超声混匀6min后，加到70ml的聚四氟乙烯反应釜中，加入8ml乙酸，将反应釜放入油浴锅中150℃反应6h。反应结束，待反应釜自然冷却至室温后，通过离心的产物依次使用dmf、乙醇和纯水洗涤，最后使用真空干燥箱90℃干燥48h，得到红褐色的产物，即为mil-88。
[0078]
(2)aunps的制备：
[0079]
将氯金酸加到纯水中，配制质量浓度为1％的氯金酸水溶液；之后利用电炉进行加热，搅拌至沸腾后，缓慢加入6ml质量浓度为4％柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌，当溶液颜色变为酒红色后，停止搅拌加热，冷却至室温后，离心、将所得沉淀物复溶于水中得到质量浓度为10％的aunps溶液。
[0080]
(3)aunp/mof协同催化材料的制备：
[0081]
称取8mg mil-88加到8ml去离子水中，混匀后取6ml上述溶液直接加到7ml aunps溶液中并磁力搅拌6h，搅拌结束后，离心和用超纯水洗涤三次得到aunps/mil-88协同催化材料，随后储存于tris-hcl(ph 7.0)中，得到1mg/ml aunps/mil-88溶液，待用。
[0082]
(3)电化学dna传感器的构建：
[0083]
取10μl 1.0mg/ml的aunps/mil-88溶液滴于玻碳电极表面，并于室温下自然干燥，随后滴加10μl 40μm的目标dna于电极表面。37℃下孵育4h后，用去离子水清洗未与aunps/mil-88结合的dna，得到电化学dna传感器。
[0084]
pb
2+
检测方法：
[0085]
(1)配制一系列不同浓度的pb
2+
标准溶液，浓度分别为0、10-14
、10-13
、10-12
、10-11
、10-10
、10-9
m。然后将电化学dna传感器浸入pb
2+
标准溶液中，一个电化学dna传感器对应一个浓度的pb
2+
标准溶液；在chi630d电化学工作站上检测记录电流减少值，从而建立电化学信号和pb
2+
溶液浓度的标准线性关系：δi＝1.0843*logc
pb2+
+2.527(r2＝0.9845)
[0086]
(2)实际样品检测：
[0087]
本发明进一步提供了上述传感界面协同催化的高灵敏电化学分析方法在菠菜叶中pb
2+
检测的应用。
[0088]
首先对菠菜叶进行预处理，在微波消解仪中进行消解，之后在控温电热板上加热，随后过滤，定容。分别取6ml上述样品溶液，作为待测溶液，然后将电化学dna传感器置于待测溶液中，记录相应的电流减少值，代入步骤(1)建立的标准线性关系中，得到待测溶液中pb
2+
的浓度；并通过加标回收法对菠菜叶样品进行回收实验，得到回收率在93.2％～99.6％之间。
[0089]
图7是实例1中利用电化学dna传感器检测不同浓度pb
2+
的标准曲线，其中横坐标为不同pb
2+
浓度的对数值，纵坐标为电流变化值。从图中可以看出，pb
2+
浓度与mb电流减小值(δi)之间存在良好的线性关系，线性回归方程为δi＝3.30423*logc
pb2+
+0.818(r2＝0.9987)。结果表明该电化学dna传感器对pb
2+
具有较高的灵敏度和检测范围，这主要归因于aunps/mil-88对mb协同催化作用和mb优异的电子传输能力。
[0090]
综上所述，本发明基于mof和aunps构建电化学传感界面，结合了mof和aunps对mb的协同催化作用、mb优异的电子传输能力和dna对pb
2+
的特异识别，实现了复杂基质中的pb
2+
准确、灵敏、快速检测。该传感体系制备简单、稳定性高、抗干扰能力强，与其它电化学方法相比具有更低的检出限，为环境、食品、农产品等基质中重金属的高灵敏检测提供了新的技术支持。
[0091]
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。