新型冠状病毒中和抗体的检测方法、检测试纸条及试剂盒与流程

1.本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒中和抗体的检测方法、检测试纸条及试剂盒。


背景技术：

2.新型冠状病毒肺炎（covid-19）是由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（sars-cov-2）引起的烈性传染病，covid-19主要的临床症状有发烧、咳嗽、气促和呼吸困难等，严重时可导致急性呼吸窘迫综合征，甚至出现多器官衰竭或死亡。
3.接种疫苗是目前人类抗击新冠疫情最重要的防控手段，其对于新冠防控和消除及全球公共卫生改善具有重要作用。目前，多家制药公司和研究机构正在依托不同技术开展疫苗研发，其中主要是灭活疫苗、腺病毒疫苗、mrna疫苗、蛋白亚单位疫苗等。此外，由于新冠病毒变异株的出现，且不同个体对疫苗的应答能力也不尽相同，机体内产生的抗体水平也有所差异，因此评估疫苗接种者对新型冠状病毒感染的免疫能力具有重要意义，可以为后续疫苗接种提供参考依据。
4.sars-cov-2通过其表面刺突蛋白的受体结合域（receptor bindingdomain ，rbd）与宿主细胞的人血管紧张素转化酶2 (angiotensin-convertingenzyme 2 ace2)受体结合，使病毒进入宿主细胞并进行病毒复制。病毒感染后，会引发免疫反应，在血液中产生可保护宿主、防止再次受到病毒感染的抗体，此抗体被称为中和抗体。中和抗体具有特异性强、亲和力高的特点，病毒进入体内后，中和抗体可与rbd蛋白结合，从而阻断与宿主细胞结合来有效的控制感染。因此，机体内中和抗体水平是免疫保护效力评价的主要指标。
5.目前，检测中和抗体的金标准是活病毒微量血清中和试验(cvnt)，使用定量的活病毒与系列稀释的血清进行蚀斑减少中和试验，通过观察细胞病变（cpe）测定中和抗体效价，但该方法需要新冠活病毒培养和鉴定环节，必须由专业人员在三级生物安全实验室（bsl-3）进行，试验周期可长达4~7天，而国内三级生物安全实验室（bsl-3）数量少、资源有限，无法满足大规模人群接种后疫苗保护效力的实时动态检测需要。目前检测中和抗体的方法还包括酶联免疫吸附法(elisa) ，酶联免疫吸附法(elisa) 虽然敏感性和特异性较高，但操作步骤繁琐，检测时间较长，以及试剂种类多不利于保存运输。
6.而且，目前关于新冠病毒中和抗体检测方法中，多采用竞争抑制法原理，即使用荧光微球标记rbd作为检测抗原，而将ace2包被在检测线上，当检测样本中不存在中和抗体时，荧光微球标记rbd与检测线上的ace2结合，检测线有荧光信号；而当检测样本中有中和抗体时，中和抗体先与荧光微球标记rbd结合，则荧光微球标记rbd不能与检测线上ace2结合，检测线没有荧光信号。因此，样本中中和抗体浓度与检测线41检测信号成反比，中和抗体浓度越高，检测线41荧光信号越弱，而且，竞争抑制法需要借助仪器读取信号值，并计算抑制率，使用不方便而且增加了检测时间，而且当检测低浓度样本时，竞争抑制法的试纸条检测线41荧光信号的轻微减弱不容易检测到，与阴性样本的差距无法拉开，容易造成弱阳样本的错判，使得灵敏度较低。


技术实现要素：

7.针对背景技术提出的问题，本发明的目的在于提出一种新型冠状病毒中和抗体的检测方法，具有检测方便快捷和灵敏度高的优点，解决了现有新型冠状病毒中和抗体检测时间长、灵敏度低和特异性差的问题。
8.本发明的另一目的在于提出一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条，具有使用方便快捷和灵敏度高的优点，解决了现有新型冠状病毒中和抗体检测试纸条检测时间长、使用不方便和灵敏度低问题，并提高了特异性。
9.本发明的又一目的在于提出一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条的制备方法，整个制备过程简单，容易实现工业化生产，而且使用的检测原料较少且易获得，能够减少原料批次更换带来的差异性。
10.本发明的再一目的在于提出一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，具有使用方便快捷和灵敏度高的优点，解决了现有新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒检测时间长、使用不方便和灵敏度低问题，并提高了特异性。
11.为达此目的，本发明采用以下技术方案：一种新型冠状病毒中和抗体的检测方法，包括以下步骤：（1）使检测样本流经喷涂有荧光标记混合物的结合垫，在所述结合垫上形成样本-荧光标记混合物，所述荧光标记混合物由铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy组成；（2）使样本-荧光标记混合物依次流经包被有rbd重组蛋白的检测线和包被有鸡igy的质控线；（3）使激发光射向检测线和质控线，若检测线和质控线均发出荧光信号，则判断为含有新型冠状病毒中和抗体，若检测线无荧光信号而质控线发出荧光信号，则判断为无新型冠状病毒中和抗体；（4）当判断为含有新型冠状病毒中和抗体，则检测检测线的荧光值和质控线的荧光值，计算检测线的荧光值和质控线的荧光值的比值，得到定量结果。
12.进一步的，在所述步骤（1）中，所述荧光标记混合物的喷涂量为2-8 μl/cm。
13.进一步的，在所述步骤（1）中，所述荧光标记混合物中所述铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和所述铕荧光微球标记的羊抗鸡igy的体积比为（5-15）：1。
14.进一步的，在所述步骤（2）中，所述检测线上包被的rbd重组蛋白的浓度为0.5-2.0 mg/ml，包被量为0.5-2.0 μg/cm。
15.进一步的，在所述步骤（2）中，所述质控线包被的鸡igy的浓度为0.5-2.0 mg/ml，包被量为0.5-2.0 μg/cm。
16.一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条，包括底板1和设置在底板1上并依次连接的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，所述硝酸纤维素膜4上设置有检测线41和质控线42，所述检测线41位于靠近所述结合垫3的一侧，所述质控线42位于靠近所述吸水垫5的一侧；所述结合垫3上喷涂有荧光标记混合物，所述荧光标记混合物由铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy组成；所述检测线41上包被有rbd重组蛋白，所述质控线42上包被有鸡igy。
17.进一步的，在所述结合垫3上，所述荧光标记混合物的喷涂量为2-8 μl/cm；所述荧光标记混合物中所述铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和所述铕荧光微球标记的羊抗鸡igy的体积比为（5-15）：1。
18.进一步的，所述铕荧光微球标记的rbd重组蛋白的浓度为5-20 μg/ml，所述铕荧光微球标记的羊抗鸡igy的浓度为10-30 μg/ml进一步的，所述检测线41上包被的rbd重组蛋白的浓度为0.5-2.0 mg/ml，包被量为0.5-2.0 μg/cm；所述质控线42包被的鸡igy的浓度为0.5-2.0 mg/ml，包被量为0.5-2.0 μg/cm。
19.一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条的制备方法，用于制备上述的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条，包括以下步骤：（1）将铕荧光微球加入到的 mes缓冲液中，避光混匀后加入edc和nhs活化铕荧光微球，离心后用mes重悬沉淀，并加入 rbd重组蛋白，避光反应1.5~2.5 h后，加入10% bsa，封闭20~40 min，离心，再用复溶液重悬沉淀，得到铕荧光微球标记的rbd重组蛋白，4 ℃避光保存备用；（2）将铕荧光微球加入到mes缓冲液中，避光混匀后加入edc和nhs活化铕荧光微球，离心后用mes重悬沉淀，并加入羊抗鸡igy，避光反应1.5~2.5 h后，加入10% bsa，封闭20~40 min，离心，再用复溶液重悬沉淀，得到铕荧光微球标记的羊抗鸡igy，4 ℃避光保存备用；（3）按配比，将铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy混合，得到荧光标记混合物，将荧光标记混合物喷涂在结合垫上，干燥后保存待用；（4）将rbd重组蛋白用喷金划膜仪包被到硝酸纤维素膜4上，得到检测线41；将鸡igy用喷金划膜仪包被到硝酸纤维素膜4上，得到质控线42，干燥完成后用铝膜袋密封保存待用；（5）按顺序将样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5组装在底板1上，采用条形切割器将组装好的板条切成 4 mm的宽度，得到新型冠状病毒中和抗体检测试纸条。
20.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，包括卡壳下底6和盖设于所述卡壳下底6外的卡壳上盖7，所述卡壳下底6的顶面设有上述的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条；所述卡壳上盖7的顶面开设有加样孔71和观察区72，所述加样孔71位于所述样品垫2的上方，所述观察区72位于所述检测线41和质控线42所在位置的上方。
21.上述技术方案具有以下有益效果：1、本方案使用双抗原夹心法原理，即使用铕荧光微球标记的rbd重组蛋白作为检测抗原，同时将rbd重组蛋白包被在检测线上作为包被抗原。在步骤（1）中，当检测样本中有中和抗体时，中和抗体与结合垫上的铕荧光微球标记的rbd重组蛋白结合形成抗原-抗体复合物，即样本-荧光标记混合物中存在抗原-抗体复合物，而中和抗体不会和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy结合，当样本-荧光标记混合物继续流经检测线时，抗原-抗体复合物和检测线上的rbd重组蛋白结合，形成双抗原夹心复合物，激发光的作用下，检测线出现荧光信号，则为阳性，即表明检测样本存在中和抗体；当检测样本中不存在中和抗体时，铕荧光微球标记的rbd重组蛋白不能与检测线（t线）上的rbd结合，不能形成双抗原夹心复合物，激发光的作用下，检测线无荧光信号，因此，检测样本中的中和抗体浓度与检测线检测信号成正比，
中和抗体浓度越高，检测线（t线）荧光信号越强。而且，通过使用便携式荧光读卡仪进行进一步的检测，通过读取的检测线的荧光值和质控线的荧光值的比值进行判定，可获得定量结果，通过计算，即可获得检测样本中中和抗体的浓度。
22.2、对原理进行改进后，可不用计算抑制率，直接获取正向信号，因此不需要使用荧光阅读仪，只需一个紫外鉴定灯就可对样本进行判读，而现有使用竞争抑制法的检测试剂条需要借助仪器读取信号值，计算抑制率，使用不方便。
23.3、检测低浓度样本时，竞争抑制法试纸条的检测线荧光信号的轻微减弱不容易检测到，与阴性样本的差距无法拉开，造成弱阳样本的错判；而本方案是正向信号，阴性样本的检测线信号值很低，而样本中只要存在少许中和抗体，就会被检测线的rbd重组蛋白捕获，检测线信号值与阴性样本的检测线信号值差距较大，可以显著区分，灵敏度更高。
附图说明
24.图1是本发明一个实施例的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的结构示意图；图2是本发明一个实施例的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条的原理图；图3是本发明一个实施例的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的检测结果示意图；图4是实施例4制备备得到的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的标准曲线图；其中：底板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5、卡壳下底6、卡壳上盖7、检测线41、质控线42、加样孔71、观察区72。
具体实施方式
25.下面结合附图及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。
26.一种新型冠状病毒中和抗体的检测方法，包括以下步骤：（1）使检测样本流经喷涂有荧光标记混合物的结合垫，在结合垫上形成样本-荧光标记混合物，荧光标记混合物由铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy组成；（2）使样本-荧光标记混合物依次流经包被有rbd重组蛋白的检测线和包被有鸡igy的质控线；（3）使激发光射向检测线和质控线，若检测线和质控线均发出荧光信号，则判断为含有新型冠状病毒中和抗体，若检测线无荧光信号而质控线发出荧光信号，则判断为无新型冠状病毒中和抗体；（4）当判断为含有新型冠状病毒中和抗体，则检测检测线的荧光值和质控线的荧光值，计算检测线的荧光值和质控线的荧光值的比值，得到定量结果。
27.目前关于新冠病毒中和抗体的检测试方法多采用竞争抑制法原理，竞争抑制法需要借助仪器读取信号值，并计算抑制率，才能获得中和抗体的浓度，使用起来不方便而且增加了整体的检测时间，而且当检测低浓度样本时，竞争抑制法的试纸条检测线荧光信号的轻微减弱不容易检测到，与阴性样本的差距无法拉开，容易造成弱阳样本的错判，使得灵敏度较低。
28.值得说明的是，羊抗鸡igy是由山羊抗血清经亲和层析纯化而得到的高纯度多克
隆抗体，羊抗鸡igy可特异性地结合鸡igy，同时，中和抗体能与rbd重组蛋白结合。本方案使用双抗原夹心法原理，即使用铕荧光微球标记的rbd重组蛋白作为检测抗原，同时将rbd重组蛋白包被在检测线上作为包被抗原。在步骤（1）中，当检测样本中有中和抗体时，中和抗体与结合垫上的铕荧光微球标记的rbd重组蛋白结合形成抗原-抗体复合物，即样本-荧光标记混合物中存在抗原-抗体复合物，而中和抗体不会和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy结合，当样本-荧光标记混合物继续流经检测线时，抗原-抗体复合物和检测线上的rbd重组蛋白结合，形成双抗原夹心复合物，在步骤（3）中，激发光的作用下，检测线出现荧光信号，则为阳性，即表明检测样本存在中和抗体；当检测样本中不存在中和抗体时，铕荧光微球标记的rbd重组蛋白不能与检测线（t线）上的rbd结合，不能形成双抗原夹心复合物，激发光的作用下，检测线无荧光信号，因此，检测样本中的中和抗体浓度与检测线检测信号成正比，中和抗体浓度越高，检测线（t线）荧光信号越强。
29.具体的，在步骤（3）中，用激发波长为365 nm的紫外鉴定灯照射检测线和质控线，可通过肉眼初步判读，若检测线有荧光信号，则检测样本中含有中和抗体，若检测线无荧光信号，则检测样本中不含有中和抗体，即得到定性结果，在步骤（4）中，通过使用便携式荧光读卡仪进行进一步的检测，通过读取的检测线的荧光值和质控线的荧光值的比值进行判定，可获得定量结果，通过计算，即可获得检测样本中中和抗体的浓度。
30.进一步的说明，本技术方案的检测信号物为铕荧光微球，铕荧光微球具有荧光寿命长(60-900 μs)、stokes位移大(280 ~300 nm)、发射光谱窄(610~620 nm)的优点，相对于使用胶体金作为检测信号物，具有灵敏度更高、稳定性更好和微球来源批间差较小的优点。
31.值得说明的是，本技术方案的新冠病毒中和抗体的检测方法使用双抗原夹心法原理具有一下优点：1.使用方便：对原理进行改进后，可不用计算抑制率，直接获取正向信号，因此不需要使用荧光阅读仪，只需一个紫外鉴定灯就可对样本进行判读，而现有使用竞争抑制法的检测试剂条需要借助仪器读取信号值，计算抑制率，使用不方便；2.灵敏度更高：检测低浓度样本时，竞争抑制法试纸条的检测线荧光信号的轻微减弱不容易检测到，与阴性样本的差距无法拉开，造成弱阳样本的错判；而本方案是正向信号，阴性样本的检测线信号值很低，而样本中只要存在少许中和抗体，就会被检测线的rbd重组蛋白捕获，检测线信号值与阴性样本的检测线信号值差距较大，可以显著区分；3.节约成本：本方案只使用一个原料rbd，而现有很多的新冠病毒中和抗体检测试纸条需要两种或两种以上的检测原料, 因此本方案原料更易获得且易于控制，可减少原料批次更换带来的差异性；4.检测时间短：只需点样、层析、读数三个步骤， 20 min内可完成检测。而现有的elisa检测试剂盒操作步骤繁琐，检测时间较长，以及试剂种类多不利于保存运输，病毒中和实验则需要4-7天。本发明大大缩短了检测时间，能够实现高通量检测。
32.优选的，在步骤（1）中，检测样本为血清或血浆样本。
33.优选的，在步骤（3）中，激发光为激发波长为365 nm的紫外鉴定灯照射所发出的光。
34.进一步的说明，在步骤（1）中，荧光标记混合物的喷涂量为2-8 μl/cm。
35.进一步的说明，在步骤（1）中，荧光标记混合物中铕荧光微球标记的rbd重组蛋白
和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy的体积比为（5-15）：1。
36.当荧光标记混合物的喷涂量为2-8 μl/cm时，且当荧光标记混合物中铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy的体积比在（5：15）：1范围内，检测线和质控线的信号较好且灵敏度较高。若喷涂量太低，会使检测线和质控线的信号太低，灵敏度达不到；若喷涂量太高，容易造成试纸条堵塞。若铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy的体积比较小，会导致检测线信号太低，灵敏度达不到；若两者的体积比较高，将造成质控线信号弱，不利于判读结果。
37.优选的，荧光标记混合物的喷涂量为4 μl/cm；荧光标记混合物中铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy的体积比为9：1，此时，检测线的灵敏度较高，且质控线的信号也较强。
38.进一步的说明，在步骤（2）中，检测线上包被的rbd重组蛋白的浓度为0.5-2.0 mg/ml，包被量为0.5-2.0 μg/cm。
39.若rbd重组蛋白的包被浓度太低会导致灵敏度低和线性范围窄，当rbd重组蛋白的包被浓度达到一定量时，荧光信号将不随包被量的增加而增加，因此，为了具有较好的灵敏度和节约成本，将检测线上包被的rbd重组蛋白的浓度设为0.5-2.0 mg/ml，包被量为0.5-2.0 μg/cm。
40.进一步的说明，在步骤（2）中，质控线包被的鸡igy的浓度为0.5-2.0 mg/ml，包被量为0.5-2.0 μg/cm。
41.值得说明的是，质控线（c线）的荧光信号作为试纸条质量控制的一个重要参数，需要一个合适且相对稳定的荧光信号值，若鸡igy的包被浓度太低，c线荧光信号值不高，不利于观察结果，甚至出现试纸条无效的结果；若鸡igy的包被浓度高，c线荧光信号值太强，检测线（t线）和质控线（c线）荧光比值太低，不利于进行计算。
42.优选的，检测线上包被的rbd重组蛋白的浓度为1 mg/ml，包被量1 μg/cm；质控线包被的鸡igy的浓度为1mg/ml，包被量1 μg/cm。
43.一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条，包括底板1和设置在底板1上并依次连接的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，硝酸纤维素膜4上设置有检测线41和质控线42，检测线41位于靠近结合垫3的一侧，质控线42位于靠近吸水垫5的一侧；结合垫3上喷涂有荧光标记混合物，荧光标记混合物由铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy组成；检测线41上包被有rbd重组蛋白，质控线42上包被有鸡igy。
44.值得说明的，检测原理如图2所示，当检测试纸条未加样时，在365 nm紫外激发光下，硝酸纤维素膜4上的检测线41和质控线42均无荧光。加入检测样品时，在毛细管作用下，样品依次经过样样品垫2、结合垫3和硝酸纤维素膜4，并向吸水垫5的方向移动。
45.若检测样品中不含新型冠状病毒中和抗体，结合垫3的铕荧光微球标记的rbd重组蛋白不会和检测样品中的其他抗体反应，无法形成双抗原夹心复合物，流经检测线41时也不会被捕获；而铕荧光微球标记的羊抗鸡igy流经质控线42时，和质控线42上鸡igy发生反应，因此在激发光的作用下，检测线41无荧光，质控线42有荧光。
46.若检测样品中有新型冠状病毒中和抗体，结合垫3上的铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和检测样品中的中和抗体反应，在检测线41形成双抗原夹心复合物，被检测线41的rbd
μl 10% bsa，封闭20~40 min，离心，用500 μl复溶液重悬沉淀，得到浓度为5-20 μg/ml的铕荧光微球标记的rbd重组蛋白，4 ℃避光保存备用。
56.优选的，在步骤（1）中加入10 μg rbd重组蛋白，使得制备得到的铕荧光微球标记的rbd重组蛋白的浓度为10 μg/ml。
57.步骤（2）的具体制备过程如下：将10 μl280~320 nm的铕荧光微球加入到990 μl的 mes缓冲液中，避光混匀后加入edc和nhs活化铕荧光微球，离心后用1000 μl mes重悬沉淀，并加入10~30 μg羊抗鸡igy，避光反应1.5~2.5h后，加入10 μl 10% bsa，封闭20~40 min，离心，用500 μl复溶液重悬沉淀，得到浓度为10~30 μg/ml铕荧光微球标记的羊抗鸡igy，4 ℃避光保存备用。
58.优选的，在步骤（2）中加入25 μg的羊抗鸡igy，使得制备得到的铕荧光微球标记的羊抗鸡igy的浓度为25 μg/ml。
59.其中，步骤（1）和步骤（2）中复溶液的制备方法如下：将0.5%-3% bsa、0.5%-3%tween-20、0.5%-3%蔗糖和0.5%-2%酪蛋白溶解于0.015 m ph7.4 pbs缓冲液中，制备得到复溶液。
60.优选的，步骤（1）和步骤（2）中，edc和nhs的质量比为（0.8~1.2）：（4~6）。值得说明的是，edc为碳二亚胺，nhs为n-羟基琥珀酰亚胺，通过将edc和nhs的质量比设为（0.8~1.2）：（4~6）能够有效活化铕荧光微球，减少副反应的发生。
61.更为优选的，步骤（1）和步骤（2）中，edc和nhs的质量比为1：5。
62.更为优选的，步骤（1）和步骤（2）中复溶液的制备方法如下：将2% bsa、2% tween-20、2% 蔗糖和1%酪蛋白溶解于0.015 m ph7.4 pbs缓冲液中，制备得到复溶液。
63.步骤（3）的具体制备过程如下：将铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy按（5-15）：1的体积比混合，得到荧光标记混合物，将荧光标记混合物以2-8 μl/cm的量喷涂在1
×
30 cm宽的结合垫上，在35~39 ℃烘箱中烘干燥过夜，干燥完成后用铝膜袋密封保存待用。
64.步骤（4）的具体制备过程如下：将0.5-2.0 mg/ml的rbd重组蛋白用喷金划膜仪以0.5-2.0 μg/ml的量包被到硝酸纤维素膜4上，得到检测线41；将0.5-2.0 mg/ml的鸡igy用喷金划膜仪以0.5-2.0 μg/ml的量包被到硝酸纤维素膜4上，得到质控线42，在35~39 ℃烘箱中烘干燥过夜，干燥完成后用铝膜袋密封保存待用。
65.步骤（5）的具体制备过程如下：将规格为20 cm
×
30 cm大小的样品垫浸泡在样品垫缓冲液中，干燥后剪裁成2 cm
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30 cm规格；并将型号为h-2的吸水纸裁剪成2.5 cm
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30 cm的小条，置于35~39 ℃烘箱干燥，得到吸水垫5；按顺序将样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5组装在底板1上，采用条形切割器将组装好的板条切成 4 mm的宽度，得到新型冠状病毒中和抗体检测试纸条。其中，样品垫缓冲液的制备方法如下：按质量百分比，将2% bsa、2 %蔗糖、0.5%海藻糖和2 % tween 20溶解于0.015 m ph7.4 pbs缓冲液中，得到样品垫缓冲液。
66.值得说明的是，底板1表面有黏性，可以直接粘贴样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，在粘贴过程中，每个部分重叠 1-2 mm，通过可编程的 hgs201 条形切割器将组装好的板条切成 4 mm的宽度，得到新型冠状病毒中和抗体检测试纸条。
67.值得说明的是本方案的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备方法的制备过
程简单，容易实现工业化生产，而且使用的检测原料较少且易获得和易于控制，可减少原料批次更换带来的差异性。
68.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，包括卡壳下底6和盖设于卡壳下底6外的卡壳上盖7，卡壳下底6的顶面设有上述的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条；卡壳上盖7的顶面开设有加样孔71和观察区72，加样孔71位于样品垫2的上方，观察区72位于检测线41和质控线42所在位置的上方。
69.值得说明的是，本技术方案中新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的使用方法如下：（1）测试之前，将检测试剂、样本稀释液和待测样本及其他检测用材料等平衡至室温；（2）将新型冠状病毒中和抗体检测试纸条取出，平放；（3）样本采集：采用血清或血浆收集管收集人静脉外周血，于1000
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1200 rpm下离心15-20 min，收集上清，即可得到检测样本，样本可在-20 ℃长期保存，样本要求无溶血，澄清透明；（4）检测过程：用样本稀释液将检测样本稀释10倍后，吸取100 μl稀释后样本滴加到试纸条的加样孔71中；（5）结果判读：反应15 min后，用激发波长为365 nm的紫外鉴定灯照射，可进行肉眼初步判读，得到定性结果；使用便携式荧光读卡仪进行检测，通过读取的检测线41的荧光值和质控线42的荧光值的比值进行判定，可获得定量结果；（6）检测结果解释（检测结果如图3所示）：阳性结果：检测线41和质控线42均有信号，判定为阳性；阴性结果：检测线41无信号，只有质控线42有信号判定为阴性；无效结果：当质控线42无信号时，无论质控线42是否有信号，则本次测试结果无效，需要重新测试。
70.具体的，将新型冠状病毒中和抗体检测试纸条粘附在卡壳下底6的顶面，并盖上卡壳上盖7，得到新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒。
71.下面结合实施例进一步阐述本技术方案。
72.实施例1一种新型冠状病毒中和抗体的检测方法，包括以下步骤：（1）将检测样本流经喷涂有荧光标记混合物的结合垫，在结合垫上形成样本-荧光标记混合物，荧光标记混合物由铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy组成；（2）将样本-荧光标记混合物依次流经包被有rbd重组蛋白的检测线和包被有鸡igy的质控线；（3）在激发光的作用下，肉眼初步判读，得到定性结果；（4）检测检测线的荧光值和质控线的荧光值，计算检测线的荧光值和质控线的荧光值的比值，得到定量结果。
73.其中，在结合垫上，荧光标记混合物的喷涂量为4 μl/cm，荧光标记混合物中铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy的体积比为9：1；检测线上包被
的rbd重组蛋白的浓度为1 mg/ml，包被量为1 μg/cm；质控线42包被的鸡igy的浓度为1 mg/ml，包被量1 μg/cm；铕荧光微球的粒径为307 nm。
74.实施例2一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条，使用实施例1的新型冠状病毒中和抗体的检测方法的原理，包括底板1和设置在底板1上并依次连接的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，硝酸纤维素膜4上设置有检测线41和质控线42，检测线41位于靠近结合垫3的一侧，质控线42位于靠近吸水垫5的一侧；结合垫3上喷涂有荧光标记混合物，该荧光标记混合物由铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy组成；检测线41上包被有rbd重组蛋白，所述质控线42上包被有鸡igy。
75.其中，在结合垫3上，荧光标记混合物的喷涂量为4 μl/cm，荧光标记混合物中铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy的体积比为9：1，铕荧光微球标记的rbd重组蛋白的浓度为10 μg/ml，铕荧光微球标记的羊抗鸡igy的浓度为25 μg/ml，检测线41上包被的rbd重组蛋白的浓度为1 mg/ml，包被量为1 μg/cm；质控线42包被的鸡igy的浓度为1 mg/ml，包被量1 μg/cm；铕荧光微球的粒径为307 nm。
76.实施例3一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条的制备方法，用于制备实施例2的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条，包括以下步骤：（1）将规格为20 cm
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30 cm大小的样品垫浸泡在样品垫缓冲液中，于室温干燥12 h，再于37 ℃鼓风干燥箱中干燥2 h，干燥后剪裁成2 cm
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30 cm规格，得到样品垫2，备用；其中，样品垫缓冲液的制备方法如下：按质量百分比，将2% bsa、2 %蔗糖、0.5%海藻糖和2 % tween 20溶解于0.015 m ph7.4 pbs缓冲液中，得到样品垫缓冲液；（2）将10 μl307 nm的铕荧光微球加入到990 μl的 mes缓冲液中，避光混匀，再按1:5的质量比加入edc和nhs活化铕荧光微球，室温避光反应30分钟，15000 rpm离心30分钟，弃上清，1000 μl mes重悬沉淀，并加入10 μg rbd重组蛋白，避光反应2 h后，加入10 μl 10% bsa，封闭30 min后，15000 rpm离心30分钟，用500 μl复溶液（0.015 m ph7.4 pbs：2% bsa：2% tween-20：2%蔗糖：1%酪蛋白）重悬沉淀，得到浓度为10 μg/ml的铕荧光微球标记的rbd重组蛋白，4 ℃避光保存备用；（3）将10 μl307 nm的铕荧光微球加入到990 μl的 mes缓冲液中，避光混匀后再按1:5的质量比加入edc和nhs活化铕荧光微球，室温避光反应30分钟，15000 rpm离心30分钟，弃上清，用1000 μl mes重悬沉淀，并加入25 μg羊抗鸡igy，避光反应2 h后，加入10 μl 10% bsa，封闭30 min，15000 rpm离心30分钟，用500 μl复溶液（0.015 m ph7.4 pbs：2% bsa：2% tween-20：2%蔗糖：1%酪蛋白）重悬沉淀，得到浓度为25 μg/ml的铕荧光微球标记的羊抗鸡igy，4 ℃避光保存备用；（4）将铕荧光微球标记的rbd重组蛋白和铕荧光微球标记的羊抗鸡igy按9：1的体积比混合，得到荧光标记混合物，将荧光标记混合物以4 μl/cm的量喷涂在1
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30 cm宽的结合垫上，在37 ℃烘箱中烘干燥过夜，干燥完成后用铝膜袋密封保存待用；（5）将1mg/ml的rbd重组蛋白用喷金划膜仪以1μl/cm的量包被到硝酸纤维素膜4上，得到检测线41；将1 mg/ml的鸡igy用喷金划膜仪以1 μl/cm的量包被到硝酸纤维素膜4
上，得到质控线42，在37 ℃烘箱中烘干燥过夜，干燥完成后用铝膜袋密封保存待用；（6）将型号为h-2的吸水纸裁剪成2.5 cm
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30 cm的小条，置于37 ℃烘箱干燥，得到吸水垫5，干燥完成后用铝膜袋密封保存吸水垫5待用；（7）按顺序将上面制备好的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5组装在底板1上，通过可编程的 hgs201 条形切割器将组装好的板条切成 4 mm的宽度，得到新型冠状病毒中和抗体检测试纸条。
77.实施例4一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，包括卡壳下底6和盖设于卡壳下底6外的卡壳上盖7，卡壳下底6的顶面设有实施例3制备得到的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条；卡壳上盖7的顶面开设有加样孔71和观察区72，加样孔71位于样品垫2的上方，观察区72位于检测线41和质控线42所在位置的上方。
78.新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备方法如下：将实施例2制备得到新型冠状病毒中和抗体检测试纸条粘附在卡壳下底6的顶面，并盖上卡壳上盖7，得到新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒。
79.具体来说，新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的使用方法，如下所示：（1）测试之前，将检测试剂、样本稀释液和待测样本及其他检测用材料等平衡至室温；（2）将新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒取出，平放；（3）样本采集：采用血清或血浆收集管收集人静脉外周血，于1000
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1200 rpm下离心15-20 min，收集上清，即可得到检测样本，样本可在-20 ℃长期保存，样本要求无溶血，澄清透明；（4）检测过程：用样本稀释液将检测样本稀释10倍后，吸取100 μl稀释后样本滴加到试剂盒的加样孔71中；（5）结果判读：反应15 min后，用激发波长为365 nm的紫外鉴定灯照射，可进行肉眼初步判读，得到定性结果；使用便携式荧光读卡仪进行检测，通过读取的检测线41的荧光值和质控线42的荧光值的比值进行判定，可获得定量结果；（6）检测结果解释（检测结果如图3所示）：阳性结果：检测线41和质控线42均有信号，判定为阳性；阴性结果：检测线41无信号，只有质控线42有信号判定为阴性；无效结果：当质控线42无信号时，无论质控线42是否有信号，则本次测试结果无效，需要重新测试。
80.具体的，通过以下方法检测实施例4制备得到的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的灵敏度与线性范围。
81.将从菲鹏生物科技公司购买得到的质控品 anti cov-19 igg 稀释一系列浓度梯度（2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、0 ng/ml）,每个浓度取100 μl溶液加入到点样孔中，并做3个重复。反应15分钟后，用荧光读卡仪读取检测线41（t线）和质控线42（c线）荧光信号，以浓度的对数值为横坐标，以t线和c线荧光信号比值的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图4所示，由此可见，本产品灵敏度极高，可达3.9 ng/ml，线性范围较宽，可覆盖3.9 ng/ml-500 ng/ml，可有效应用于临床样本的检测。
82.具体的，通过以下方法测试实施例4制备得到的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的重复性（1）批内重复性同一批次试剂盒检测3个浓度样本，并做3个重复，由t线和c线荧光信号比值代替t线荧光信号值。由表1可知，同一样本的变异系数(cv)均小于10%，证明该试剂盒在样品检测中是稳定的，具有较高的可靠性。
83.（2）批间重复性制备5批试剂盒，分别检测3个浓度样本，由t线和c线荧光信号比值代替t线荧光信号值。由表2可知，同一样本不同批次的cv值小于10%，说明不同批次间的试剂盒相对稳定，具有良好的重复性。
84.实施例5新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的临床应用收集新冠疫苗接种者不同时间点临床血清398例，并使用金标准——活病毒微量血清中和试验(cvnt)测定中和抗体滴度，由于抗体滴度低于4时，对病毒的阻断效果较弱，因此将滴度小于4的样本判断为阴性，大于或等于4的样本判断为阳性。
85.并使用实施例4制备得到的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒对临床血清398例进行检测，本检测结果如表3所示，由此可见与金标准方法相比，本技术方案的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒具有较高的符合率，阴性符合率为95.42%，阳性符合率为96.2%，总符合率为95.73%。
86.将398例临床血清中197份血清用竞争抑制法elisa试剂盒进行检测，与活病毒微量血清中和试验(cvnt)相比，结果如表4所示，该竞争抑制法elisa试剂盒灵敏度强，阴性符合率为100%，但特异性较低，阳性符合率仅为69.07%，总符合率为84.77%。
87.以上结果表明，本技术方案制备得到的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒在特异性方面优于竞争法elisa检测试剂盒，且操作简便，可以用于血清样本中新冠病毒中和抗体的快速检测，并且与金标准方法具有良好的一致性，是一种对新冠病毒中和抗体检测有效且便捷的检测方法。
88.以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。