一种血红蛋白氧载体中游离Fe的制作方法

一种血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的检测方法
技术领域
1.本技术涉及元素含量检测技术领域，特别是涉及一种血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的检测方法。


背景技术：

2.血红蛋白氧载体(hemoglobin-based oxygen carriers,hbocs)是一种新兴的具有携氧功能的血液代用品，具有可长时间保存、无需配型、便于运输、感染风险低等优点。在以牛血为原料制备的血液代用品血红蛋白氧载体中，包含有结合铁和游离铁。结合铁是血红蛋白的重要构成部分，血红蛋白进入血细胞后，完全可以起到携带和释放氧气的功能；而游离的三价铁离子(游离fe
3+
)则没有这方面的功能，也不能为人体所吸收，如果游离fe
3+
含量过多，则会患高铁血红蛋白血症，一种比较少见的代谢性疾病，严重影响身体的健康，所以在hbocs中游离fe
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的含量就需要严格控制，而目前还未有能够用于检测hbocs中游离fe
3+
含量的检测方法，因此需要建立一种血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的检测方法，以能够可信、准确地对血红蛋白氧载体进行质量控制。


技术实现要素：

3.本技术的目的在于提供一种血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的检测方法，以实现血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的准确检测。具体技术方案如下：
4.本技术提供了一种血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的检测方法，其包括以下步骤：
5.(1)建立fe
3+
的标准曲线：
6.取硫酸铁铵标准品，加入水和浓硫酸，配制成fe
3+
浓度为80-120μg/ml的标准储备液；其中，水和浓硫酸的体积比为100：(0.15-0.25)；
7.取不同体积的标准储备液，加入水、浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液，配制5-10个含有不同浓度fe
3+
的标准品溶液；其中，所述标准品溶液中fe
3+
的浓度为0.12-5μg/ml；所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的体积比为1：(1.5-2.5)：(15-25)，所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的总体积和所述标准品溶液的体积比为(0.15-0.2)：1；
8.在紫外检测条件下，取各标准品溶液检测，获得各标准品溶液中fe
3+
的吸光度；
9.以各标准品溶液中fe
3+
的吸光度为纵坐标，以各标准品溶液中fe
3+
的浓度为横坐标，建立fe
3+
的标准曲线；
10.(2)获得待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的吸光度：
11.取待测血红蛋白氧载体，加入水、浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液，配制待测样品溶液；其中，所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的体积比为1：(1.5-2.5)：(15-25)，所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的总体积和所述待测血红蛋白氧载体的体积、所述待测样品溶液的体积比为(0.15-0.2)：(0.005-0.015)：1；
12.在与步骤(1)相同的紫外检测条件下，取所述待测样品溶液检测，获得待测样品溶液中游离fe
3+
的吸光度；
13.(3)确定待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的含量：
14.根据已建立的fe
3+
的标准曲线，由待测样品溶液中fe
3+
的吸光度，获得待测样品溶液中fe
3+
的浓度c1，按照公式c＝c1
×
n计算待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的含量；其中，n＝v1/v2，v1为所述待测样品溶液的体积，v2为所述待测血红蛋白氧载体的体积。
15.本技术提供的一种血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的检测方法，通过对待测血红蛋白氧载体的特殊处理，且处理方法简单，并采用本技术的紫外检测条件检测待测样品溶液，可以准确检测血液代用品血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的含量，同时又不会破坏以结合铁形式存在的物质，能够排除血红蛋白氧载体中结合铁对游离铁的干扰；所述检测方法具有操作简便、节约成本、分析速度快、专属性好、准确度高等优势，从而能够可信、准确地用于对血红蛋白氧载体的质量控制。
附图说明
16.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
17.图1为fe
3+
在扫描波长为250-650nm的紫外检测条件下的扫描光谱图。
18.图2为建立的fe
3+
的标准曲线图。
具体实施方式
19.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员基于本技术所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
20.本技术提供了一种血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的检测方法，其包括以下步骤：
21.(1)建立fe
3+
的标准曲线：
22.取硫酸铁铵标准品，加入水和浓硫酸，配制成fe
3+
浓度为80-120μg/ml的标准储备液；其中，水和浓硫酸的体积比为100：(0.15-0.25)；
23.取不同体积的标准储备液，加入水、浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液，配制5-10个含有不同浓度fe
3+
的标准品溶液；其中，所述标准品溶液中fe
3+
的浓度为0.12-5μg/ml；所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的体积比为1：(1.5-2.5)：(15-25)，所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的总体积和所述标准品溶液的体积比为(0.15-0.2)：1；
24.在紫外检测条件下，取各标准品溶液检测，获得各标准品溶液中fe
3+
的吸光度；
25.以各标准品溶液中fe
3+
的吸光度为纵坐标，以各标准品溶液中fe
3+
的浓度为横坐标，建立fe
3+
的标准曲线；
26.(2)获得待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的吸光度：
27.取待测血红蛋白氧载体，加入水、浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液，配制待测样品溶液；其中，所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的体积比为1：(1.5-2.5)：(15-25)，所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的总体积和所述待测血红蛋白氧载体的体
积、所述待测样品溶液的体积比为(0.15-0.2)：(0.005-0.015)：1；
28.在与步骤(1)相同的紫外检测条件下，取所述待测样品溶液检测，获得待测样品溶液中游离fe
3+
的吸光度；
29.(3)确定待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的含量：
30.根据已建立的fe
3+
的标准曲线，由待测样品溶液中fe
3+
的吸光度，获得待测样品溶液中fe
3+
的浓度c1，按照公式c＝c1
×
n计算待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的含量；其中，n＝v1/v2，v1为所述待测样品溶液的体积，v2为所述待测血红蛋白氧载体的体积。
31.本技术中，在步骤(1)所述标准品溶液中，除加入标准储备液及一定体积比的浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液外，余量用水补齐所述标准品溶液的体积；在步骤(2)所述待测样品溶液中，除加入待测血红蛋白氧载体及一定体积比的浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液外，余量用水补齐所述待测样品溶液的体积。
32.本技术中，所述水可选用蒸馏水或去离子水，本技术对此没有特别的限定，只要能够实现本技术的目的即可。
33.本技术中，通过对待测血红蛋白氧载体的特殊处理，获得所述待测样品溶液，使得所述待测血红蛋白氧载体中的游离fe
3+
，能够与scn-生成血红色络合物fe(scn)3，通过紫外检测测定其吸光度，用标准曲线法计算所述待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的含量；本技术中，所述待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的含量以浓度表示。
34.本技术提供的一种血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的检测方法，通过对待测血红蛋白氧载体的特殊处理，处理方法简单，并采用本技术的紫外检测条件检测待测样品溶液，从而准确地检测出血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的含量。
35.优选地，所述标准储备液中fe
3+
浓度为90-110μg/ml。
36.在本技术的一些实施方式中，所述浓硫酸的质量分数≥70％，所述过硫酸钾溶液的质量分数为0.8-1.2％，所述硫氰化钾溶液的质量分数为8-12％。
37.本技术中，可通过称取过硫酸钾，加水溶解获得质量分数为0.8-1.2％的过硫酸钾溶液；例如称取10g过硫酸钾，加990ml水溶解获得质量分数为1％的过硫酸钾溶液。本技术中，可通过称取硫氰化钾，加水溶解获得质量分数为8-12％的硫氰化钾溶液；例如称取10g硫氰化钾，加90ml水溶解获得质量分数为10％的硫氰化钾溶液。
38.发明人研究中发现，当采用质量分数在本技术范围内的浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液时，所获得的待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的检测结果准确度好。
39.在本技术的一些实施方式中，步骤(1)中，所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的体积比为1：(1.8-2.2)：(18-22)；步骤(2)中，所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的体积比为1：(1.8-2.2)：(18-22)。
40.在本技术的一些实施方式中，步骤(1)中，所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的总体积和所述标准品溶液的体积比为(0.17-0.19)：1；步骤(2)中，所述浓硫酸、过硫酸钾溶液、硫氰化钾溶液的总体积和所述待测血红蛋白氧载体的体积、所述待测样品溶液的体积比为(0.17-0.19)：(0.008-0.012)：1。
41.在本技术的一些实施方式中，所述标准品溶液经配制后，静置8-12min，离心后检测。
42.在本技术的一些实施方式中，所述待测样品溶液经配制后，静置8-12min，离心后
检测。
43.本技术对所述离心没有特别的限定，只要能够保证离心后用于检测的溶液澄清，不影响吸光度的测定即可，示例性地，可采用8000-12000r/min离心3-5min。
44.在本技术的一些实施方式中，所述紫外检测条件包括：检测波长为460-500nm；优选地，所述检测波长为470-490nm。
45.发明人在研究中发现，采用本技术的检测波长，能够准确获得所述待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的检测结果。
46.下面对本技术实施例所需的仪器和试剂进行说明。
47.仪器：紫外分光光度计，电子天平(感量0.01mg)；试剂：硫酸铁铵标准品，浓硫酸，过硫酸钾，硫氰化钾。以下实施例中所涉及的试剂如无特殊说明均可来源于市售或按照本领域公知方法取得。
48.检测波长的确定
49.精密称取0.08631g硫酸铁铵标准品，置于100ml容量瓶，加蒸馏水溶解，加4滴质量分数为98％的浓硫酸(约0.2ml)，并用蒸馏水定容，配制成fe
3+
浓度为100μg/ml的标准储备液；
50.吸取标准储备液1ml，置于25ml容量瓶，加入蒸馏水5ml、质量分数为98％的浓硫酸0.2ml、质量分数为1％的过硫酸钾溶液0.4ml、质量分数为10％的硫氰化钾溶液4.0ml，并用蒸馏水定容，静置10min，离心，配制fe
3+
待测标准溶液；
51.在设置扫描波长为250-650nm的紫外检测条件下，取fe
3+
待测标准溶液倒入比色皿，经紫外分光光度计检测，获得fe
3+
的扫描光谱图如图1所示，根据图1可以看出，fe
3+
待测标准溶液在480nm处有最大吸收，将波长为480nm作为本技术的检测波长，根据图1最大吸收波长的确定，确认本技术fe
3+
含量的检测方法专属性好。
52.实施例1
53.(1)建立fe
3+
的标准曲线：
54.精密称取0.08631g硫酸铁铵标准品，置于100ml容量瓶，加蒸馏水溶解，加4滴质量分数为98％的浓硫酸(约0.2ml)，并用蒸馏水定容，配制成fe
3+
浓度为100μg/ml的标准储备液；
55.精密吸取标准储备液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置于25ml容量瓶，加入蒸馏水5ml、质量分数为98％的浓硫酸0.2ml、质量分数为1％的过硫酸钾溶液0.4ml、质量分数为10％的硫氰化钾溶液4.0ml，并用蒸馏水定容，静置10min，离心，配制空白溶液和5个含有不同fe
3+
浓度的标准品溶液，浓度如表1所示；
56.在检测波长为480nm的紫外检测条件下，取各标准品溶液倒入比色皿，经紫外分光光度计检测，获得各标准品溶液中fe
3+
的吸光度；其中，以加入标准储备液为0ml的空白溶液作为空白调零；
57.以各标准品溶液中fe
3+
的吸光度为纵坐标(y)，以各标准品溶液中fe
3+
的浓度为横坐标(x)，建立fe
3+
的标准曲线，如图2所示，得到fe
3+
的线性方程及相关系数结果如表1所示，可见相关系数r2≥0.99，具有良好的线性关系。
58.表1 fe
3+
的线性方程及相关系数
+
的浓度c1，按实施例1的计算公式计算，获得6份待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的含量，并计算其平均值和rsd，结果如表2所示。
73.根据表2可知，人员1制备的6份待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的rsd为1.8％，即人员1的重复性rsd为1.8％，满足rsd≤6％；人员2制备的6份待测血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的rsd为0.9％，即人员2的重复性rsd为0.9％，满足rsd≤6％；结果表明本技术的方法重复性良好。
74.中间精密度：中间精密度rsd值为不同人员的重复性rsd值之和，根据表2可知，由不同人员在不同时间操作的重复性检测结果，计算中间精密度rsd为2.7％，满足rsd≤6％，结果表明本技术的方法中间精密度良好。
75.表2重复性和中间精密度结果
[0076][0077]
耐用性试验
[0078]
稳定性：将配制好的标准储备液分别在室温下放置0h、2h、6h、8h、10h、24h，精密吸取各时间点的标准储备液0.6ml，置于25ml容量瓶，加入蒸馏水5ml、质量分数为98％的浓硫酸0.2ml、质量分数为1％的过硫酸钾溶液0.4ml和质量分数为10％的硫氰化钾溶液4.0ml，并用蒸馏水定容到25ml，放置10min，离心，得到各时间点的标准品溶液；并按实施例1的紫外检测条件分别检测(以加入标准储备液为0ml的空白溶液作为空白调零)，记录各时间点的标准品溶液中fe
3+
的吸光度，并计算其rsd(％)，结果如表3所示。根据表3可知，各时间点的标准品溶液中fe
3+
的吸光度rsd为0.42％，满足rsd≤6％，表明本技术的标准储备液稳定性良好，在室温下能够保存至少24h。
[0079]
表3稳定性结果
[0080]
时间(h)吸光度00.278820.278660.278580.2796
100.2815240.2803rsd(％)0.42
[0081]
回收率试验
[0082]
精密吸取待测血红蛋白氧载体0.25ml，分别置于25ml容量瓶中，分成3组，每组3个样，于每组中分别精密加入上述标准储备液(fe
3+
浓度100μg/ml)0.1ml、0.1ml、0.1ml，0.2ml、0.2ml、0.2ml，0.4ml、0.4ml、0.4ml，分别加入蒸馏水5ml、质量分数为98％的浓硫酸0.2ml、质量分数为1％的过硫酸钾溶液0.4ml和质量分数为10％的硫氰化钾溶液4.0ml，用蒸馏水定容到25ml，放置10min，离心，得到9个加标样品溶液；并按实施例1的紫外检测条件分别检测(以加入标准储备液为0ml的空白溶液作为空白调零)，得到各加标样品溶液中游离fe
3+
的吸光度，计算得到各加标样品溶液中游离fe
3+
的浓度；由各加标样品溶液中游离fe
3+
的浓度-各待测样品溶液中游离fe
3+
的浓度，计算得到测得的加标浓度，并根据公式：回收率(％)＝测得的加标浓度/实际加标浓度
×
100％，计算得到各加标样品溶液的回收率，结果如表4所示。根据表4可知，3个不同加标浓度的回收率分别是102.6％、93.4％和96.1％，满足回收率要求的范围80-115％，结果表明本技术的方法准确度高。
[0083]
表4回收率结果
[0084][0085]
基于回收率的结果分析：如果本技术的方法会破坏结合铁，则加标后所测得的回收率结果很难满足80-115％范围的要求；而本技术回收率的结果为93.4-102.6％，证明了本技术的方法不会破坏以结合铁形式存在的物质，能够排除血红蛋白氧载体中结合铁对游离铁的干扰，能够准确测定血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的含量，针对性强，专属性好。
[0086]
本技术提供的一种血红蛋白氧载体中游离fe
3+
含量的检测方法，可以准确检测血液代用品血红蛋白氧载体中游离fe
3+
的含量，能够排除血红蛋白氧载体中结合铁对游离铁的干扰；所述检测方法具有操作简便、分析速度快、专属性好、准确度高等优势。
[0087]
以上所述仅为本技术的较佳实施例，并非用于限定本技术的保护范围。凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本技术的保护范围内。