系统性红斑狼疮合并肺动脉高压的生物标志物及其应用

1.本发明属于生物检测领域，具体涉及系统性红斑狼疮合并肺动脉高压的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,pah)是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,sle)的一种少见但严重影响预后的并发症，其起病隐匿、病情进展迅速、治疗反应不佳，全球最大样本量的多中心队列研究(chinese sle treatment and research group,cstar)结果显示sle-pah患者5年死亡率超过20％，已成为当前sle患者主要死因之一，严重危害sle患者的预后及生活质量，给社会及家庭带来沉重负担。
3.既往临床遗传学研究已经证明，约80％家族性pah患者可检测到骨形成蛋白受体-2(bone morphogenetic protein receptor type 2，bmpr2)基因突变，进而导致bmp/tgf-β通路表达异常，促进肺动脉内皮细胞(paec)增殖和肺血管重构，由此深入展开了bmp/tgf-β通路在pah血管重塑的分子机制研究。进一步深入研究发现，即使不存在bmpr2突变的ipah患者中，多种上游因素引起bmpr2表达异常，亦可以通过bmp/tgf-β信号通路使肺血管各类细胞呈现增殖增强、凋亡抑制状态。其中，肺动脉血管壁paec作为持续受到流动血液流体力学作用的一类细胞，有着屏障、调节血管张力、抗凝促纤溶、参与炎症反应和协同血管平滑肌与血管重构的重要功能，而多种因素导致的paec受损和凋亡启动成为pah发病的关键始动因素。
4.目前sle-pah中尚缺乏可靠的遗传学标志物用于早期识别及预后评估。本团队前期对sle-pah进行了初步遗传学芯片研究，并未发现bmpr2风险突变位点在这群患者中聚集，亦提示其可能存在不同的遗传学机制。在此基础上，本团队进一步利用病例资源优势，在基因组层面探寻sle-pah易感位点，为疾病防治提供有效的候选靶点。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供系统性红斑狼疮合并肺动脉高压的生物标志物及其应用。
6.首先，本发明提供对肿瘤坏死因子受体相关因子5，即traf5或其片段为反应性的抗体在制备用于诊断系统性红斑狼疮(sle)合并肺动脉高压(pah)疾病的试剂中的用途。
7.其中，所述诊断包括：测定获自呈现系统性红斑狼疮(sle)合并肺动脉高压(pah)的患者的生物样品中traf5或其片段的水平；任选地，
8.与对照数据比较所述生物样品中traf5或其片段的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中traf5或其片段的可检测的降低表明患红斑狼疮(sle)合并肺动脉高压(pah)的可能性。
9.其中，所述生物样品为所述生物样品为外周血、血清和/或外周血单个核细胞。
10.其中，traf5或其片段的水平通过以下步骤来测量，包括：
11.a.使来自患者的生物样品与所述抗体接触；
12.b.在生物样品中存在的traf5或其片段与所述抗体之间形成抗体-蛋白质复合物；
13.c.洗涤来除去任何未结合的抗体；
14.d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；
15.e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；
16.f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号；其中可检测信号的存在表明所述患者中存在traf5或其片段。
17.其中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。
18.其次，本发明还提供traf5基因作为生物标志物在制备用于诊断系统性红斑狼疮(sle)合并肺动脉高压(pah)疾病的试剂中的用途。
19.其中，所述诊断包括：测定获自呈现系统性红斑狼疮(sle)合并肺动脉高压(pah)的生物样品中traf5基因的表达水平；任选地，
20.与对照数据比较所述生物样品中traf5基因的表达水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中traf5基因的表达水平可检测的降低表明患系统性红斑狼疮(sle)合并肺动脉高压(pah)的可能性。
21.其中，所述生物样品为外周血、血清和/或外周血单个核细胞。
22.其中，traf5基因的表达水平通过以下步骤来测量：反转录pcr、real-time pcr、southern blotting和/或western blot。
23.本发明还提供一种系统性红斑狼疮(sle)合并肺动脉高压(pah)检测试剂盒，其包括对traf5或其片段为反应性的抗体，或用于扩增traf5基因的引物对。
24.在本发明的一个具体实施方案中，
25.pah是sle的一种严重影响预后的并发症，早期识别、及时精准干预是当前我国提高sle-pah诊治水平的关键环节，而当前pah相关治疗以靶向药物为主，国内原研药物尚处空白，治疗药物花费巨大，给国家医保及患者家庭带来巨大经济负担，亟待探寻pah发病相关新型标记物，阐明pah发病机理，探索新的潜在药物治疗靶点。同时，不同于欧美国家以系统性硬化症相关pah为主，我国sle-pah是当前我国最常见的ctd-pah类型，占比超过50％，患者群体人数远超过欧美国家。因此，在我国开展针对sle-pah的发病机制及临床转化研究极具优势和重要临床意义。
26.本发明首次基于大样本sle-pah基因组学关联分析技术发现sle-pah特有易感基因traf5，并初步证实sle-pah患者pbmc中traf5的转录水平显著降低，基于此，首次提出traf5的缺失在sle-pah的发病机制中起关键性作用。该发现为sle-pah发病风险公开了一种sle-pah生物标志物，包括traf5基因突变或traf5表达异常。
附图说明
27.图1所示为全外显子组测序gene-based关联分析中基因突变形式、突变数量及患者与健康对照中突变分布
28.图2所示为人肺内皮细胞的rna测序数据。
29.图3所示为sle-pah患者外周血pbmc traf5表达水平差异。
30.图4所示为构建敲低traf5的si-rna traf5表达改变。
31.图5所示为traf5敲低载体构建图谱，包含egfp荧光信号，u6启动子，ampicillin抗性，全长8347bp。
32.图6所示为tnf-α刺激si-control及si-traf5转染paec。
33.图7所示为si-traf5组逃逸死亡paec表现。
具体实施方式
34.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
35.患者入组标准及生物样本获取
36.(1)严格遴选sle-pah患者，患者需符合sle的分类标准(参照2009年sle国际协作组slicc/acr标准)；且经rhc证实的血流学动力学指标符合pah的诊断标准(参照2018年世界卫生组织《who》肺高压第五次会议的分类中属第i类)：
①
静息时平均肺动脉压(mpap)≥25mmhg；
②
肺动脉楔压(pawp)≤15mmhg；
③
肺血管阻力(pvr)》3wus；同时需要排除如下情况：合并其他结缔组织病：如系统性硬化症、类风湿关节炎、皮肌炎等。合并以下原因引起pah：
①
门静脉高压、遗传性出血性毛细血管扩张症等；
②
先天性心脏病；
③
慢性血栓栓塞性疾病肺高压：肺通气/灌注显像提示肺血栓栓塞中、高度可疑，或ctpa证实肺动脉血栓栓塞。慢性缺氧性疾病相关肺高压：中度或重度阻塞性肺病：fev1《55％；
④
中度或重度限制性肺病：tlc《60％。全面收集患者临床信息、包括人口统计学资料、基线病情、自身抗体、血流动力学参数等，每3-6个月规律随诊患者，随访时间至少为3年，密切观察并记录患者病情变化及转归。
37.实施例1基因组学研究筛选traf5为sle-pah易感基因
38.团队已经基于cstar平台收集了150例经右心导管(right heart catheterization，rhc)确诊的sle-pah的患者，匹配1000例健康对照，通过全外显子组测序(whole exome sequencing，wes)技术，对探针杂交富集外显子区的dna序列高通量测序，经过数据质量控制及过滤，突变位点有害性过滤以及基因负荷关联分析，寻找与蛋白质功能变异相关的遗传突变。
39.通过gene-based关联分析探索低频有害突变(maf＜0.05)与sle-pah疾病遗传易感性间的关系。我们共检测到了53762个低频突变，位于15112基因上，至少有2个突变的基因有11011个。将低频有害突变按照突变类别划分成8组，每一组通过gene-based关联分析(fisher精确检验)比较150个sle-pah与1000个正常对照组的差异。结果显示有9个基因的p＜0.05，分别为traf5、ano5、usp32、pld1、rfc1、taar1、irf5、stk11、pfkfb3。经多种预测软件预测，肿瘤坏死因子受体相关因子5(traf5)突变形式会导致蛋白质表达异常，为有害突变(图1)。
40.实施例2转录组验证traf5在sle-pah中异常表达
41.在转录层面，团队收集健康对照(nh)、sle-pah、sle-npah患者外周血单个核细胞(pbmc)各10例。检测结果显示，sle-pah患者pbmc中traf5的转录水平显著降低，表明外周血traf5可作为sle-pah的临床诊断标志物。
42.具体实施步骤如下：
43.1.采取入组患者与健康对照外周血9ml；血浆收集：500g离心10min收集上清血浆，分装于1.5ml离心管(1ml/tube)，至少5管。-80℃保存；pbmc分离：下层沉淀加入等体积pbs稀释，50ml离心管加入等体积分离液，将稀释血样平铺于分离液上方，保持液面界限清晰；rt、800g离心30min，白膜即为淋巴细胞与单核细胞，小心吸取白膜至15ml离心管，pbs洗涤2次，250g离心10min，弃上清，可用细胞冻存液保存于-80℃(详见达科为pbmc提取试剂盒)；pbmc-rna提取：使用qiagen柱式rna提取试剂盒。
44.2.检测rna纯度与浓度，按照逆转录试剂盒(上海奕杉生物科技有限公司，rt001)说明，将rna逆转录为cdna。
45.3.将逆转录产物进行后续荧光定量pcr反应，按照super sybr green qpcr master mix(上海奕杉生物科技有限公司，qp002)说明，对靶基因进行定量检测。
46.所涉及的rt-qpcr引物如下：
47.gapdh-faacggatttggtcgtattgggcgapdh-raacggatttggtcgtattgggcβ-actin-fcatcacgatgccagtggtacgβ-actin-raaccgcgagaagatgacccagtraf5_fcgagccccacaatggcttatraf5_rccgctccacaaactggtactbmpr2_fgctaaaatttggcagcaagcbmpr2_rcttgggccctatgtgtcactpfkfb3_f2attgcggttttcgatgccacpfkfb3_r2gccacaactgtagggtcgtrfc1_fgccatcgccaagcaattacarfc1_rttcgagcctttttggtcttggstk11_faggctcttacggcaaggtgastk11_rgccgtaacctcctcagtagt
48.收集nh、sle-pah、sle-npah患者外周血单个核细胞(pbmc)各10例，rt-qpcr检测结果显示，在sle-pah患者pbmc中traf5的表达量特异性降低(统计分析t检验，p＜0.05)，而基于wec测序筛选出的其他候选基因(pfkfb3，rfc1，stk11等)并未发现差异性表达；bmpr2为已知pah易感基因，也未在sle-pah患者中检测出异常(图2)。
49.实施例3体外试验验证traf5的缺失对人肺动脉内皮细胞功能的影响
50.traf5是tnf-r超家族和toll样/白细胞介素-1受体(toll/il-1 receptor，tir)超家族信号通路上游重要的衔接分子；与细胞增殖、分化和凋亡过程相关，在天然免疫及获得性免疫中发挥重要作用。研究表明，traf5异常与炎症性疾病、自身免疫病、心脑血管疾病相关，包括白塞综合征、心室肥厚、缺血性脑梗死、动脉粥样硬化等，而目前尚无traf5与pah的相关性研究。在我们的研究中发现，traf5在paec中存在转录表达，通过敲降traf5可以促进tnf-α诱导的paec死亡，并增强其迁移能力，由此推论traf5缺失可能在paec中介导炎症反应，从而诱导paec功能异常和sle-pah肺血管重塑的发生。
51.1.确认traf5在人肺动脉内皮细胞的表达
52.参考了geo(gene expression omnibus)里针对人肺内皮细胞的rna测序数据
(gse89787)，如图3：所有表达基因的fpkm(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)中位数值为6.36，traf5表达量为14.5，其同源基因traf2表达量为8.83，在paec中起重要调控作用导致pah的bmpr2表达量为22.55，pecam1作为paec特异性标志基因，表达量为241.65。
53.2.敲降traf5
54.构建了敲低traf5的si-rna三个，并转染至人源原代肺内皮细胞，rt-qpcr及wb验证traf5表达量降低，其中si-traf5-2效率最高(图4)，因此后续实验选用si-traf5-2进行敲低实验。
55.1)人源肺动脉内皮细胞(conventional h9 hecs.wicell,madison usa)在egm-2mv培养基及10％胎牛血清(fbs)置于培养箱培养，所有实验中将细胞用于第3到8代。
56.2)验证为有效敲低traf5的靶序列为：ggctgtgctgtaacggataaa，设计构建载体图谱如图5所示。
57.3)按照typical rnaimax transfection procedure(life technologies,man0007825)所示说明将敲低si-rna转染至肺动脉内皮细胞。具体步骤为：将细胞60-80％接种于细胞培养6孔板，将rnaimax在opti-mem中稀释，1:1加入si-rna，5分钟孵育后将混合物加入培养细胞的6孔板中，6小时后换成常规培养液，1-3天检测。
58.3.traf5的缺失影响肺动脉内皮细胞功能
59.研究表明，肺动脉内皮细胞受损与凋亡是肺动脉高压形成的起始病理因素，我们认为，在炎症刺激下，traf5的缺失会加重这一病理现象，从而参与肺动脉高压致病。本实验用炎症因子tnf-α刺激si-control及si-traf5转染的肺动脉内皮细胞，24小时后分别收取各组细胞，按照凋亡试剂盒(annexin v apc apoptosis detection kit)所示步骤将细胞染色annexin v与7-aad，经流式细胞术检测，死亡细胞在traf5敲降组增多(si-control:8％；si-traf5:12.3％)(图6)，表明traf5是维持肺动脉内皮细胞稳态的保护性因素，而在炎症刺激下，traf5的缺失可能参与肺动脉高压的发病，与我们的假说相符。
60.4.traf5的缺失促进肺动脉内皮细胞异常增殖与迁移
61.在肺动脉高压的形成过程中，肺动脉内皮细胞的异常增值与迁移力是导致肺血管管壁重塑的重要原因，本实验用划痕实验验证，在炎症因子tnf-α刺激24h后，traf5缺失的肺动脉内皮细胞表现出异常的增值与迁移力(图7)，表明traf5是维持肺动脉内皮细胞稳态的保护性因素，而在炎症刺激下，traf5的缺失可能参与肺动脉高压的发病，与我们的假说相符。
62.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。