1.本发明属于农药检测
技术领域：
：，更具体地，涉及一种提取和衍生同步进行的草甘膦快速测定方法。
背景技术：
：：2.草甘膦是20世纪70年代美国孟山都公司开发的一种具有灭生性的内吸型高效除草剂。近年来，随着转基因抗草甘膦作物的大面积种植，草甘膦的使用量越来越大，是目前用量居世界第一大转基因作物耐受除草剂。随着草甘膦的广泛使用，其进入环境后容易与土壤强烈结合，造成污染，同时通过作物的富集传递，最终影响人类的食品安全。因此，为保障农产品安全，有必要开展土壤中草甘膦的残留状况监测，而建立相关分析检测方法是关键。3.草甘膦为强极性化合物，限制了很多常规气相色谱标准衍生方法的应用。因此，高效液相色谱法在草甘膦检测中应用广泛。由于缺少发色基团和荧光基团，故在利用高效液相色谱法进行检测前必须进行衍生。现有土壤中草甘膦的高效液相色谱检测方法前处理一般包括提取、净化和衍生等步骤，比如hj1055-2019采用磷酸钠和柠檬酸钠混合提取液超声提取、正己烷净化和9-芴甲基氯甲酸酯衍生；比如专利cn110441448a采用磷酸钠超声提取、正己烷净化和9-芴甲基氯甲酸酯衍生；比如王运儒等在《柱前衍生-固相萃取-高效液相色谱荧光法测定土壤中草甘膦的残留》研究中采用碳酸氢钠超声提取、9-芴甲基氯甲酸酯衍生和hlb小柱净化。上述方法均存在前处理步骤繁琐、耗时，容易引入人为误差，同时引入有机溶剂存在环境二次污染风险，不适合实际大批量样品的快速准确检测。技术实现要素：4.针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种提取和衍生同步进行的草甘膦快速测定方法，通过在线衍生一步完成提取和衍生化步骤，利用简单的吸附剂颗粒分散固相萃取和盐析作用完成提取液的净化，以绿色高效的方式完成土壤或沉积物中草甘膦样品的前处理，解决了现有草甘膦测定方法中前处理步骤繁琐、费时且引入有机试剂导致环境二次污染，不适合大批量样品前处理等的技术问题。5.为实现上述目的，本发明提供了一种提取和衍生同步进行的草甘膦快速测定方法，其特征在于，包括如下步骤：6.(1)样品提取和衍生化：将待测样品和硅藻土混合制成流沙状混合样品后，将该混合样品与四硼酸盐溶液和衍生试剂混合，进行在线提取和衍生，得到衍生化后的提取液；7.(2)分散固相萃取和盐析净化：将步骤(1)获得的衍生化后的提取液固液分离后得到的液相与吸附剂颗粒和氯化钠充分混合，利用吸附剂颗粒的吸附作用和氯化钠的盐析作用对该衍生化后的提取液进行净化，固液分离后得到净化后的水相提取液；8.(3)对步骤(2)获得的净化后的水相提取液中的草甘膦进行定性和定量分析检测。9.优选地，步骤(1)将待测样品与硅藻土按照质量比1:2-2:1混合后研磨，制成流沙状混合样品。10.优选地，步骤(1)所述衍生试剂为9-芴甲基氯甲酸酯的乙腈溶液，其中所述衍生试剂中9-芴甲基氯甲酸酯的浓度为5-20g/l；所述四硼酸盐溶液中四硼酸盐的浓度为0.05-0.10mol/l，每克所述待测样品中加入的所述四硼酸盐溶液为2-5毫升；所述衍生试剂与所述四硼酸盐溶液的体积比为1:1-2:1。11.优选地，步骤(1)将所述混合样品与四硼酸盐溶液和衍生试剂混合，在震荡、搅拌或超声条件下进行在线提取和衍生，提取和衍生时间为1-2小时。12.优选地，步骤(2)将步骤(1)获得的衍生化后的提取液固液分离，所述固液分离为离心分离。13.优选地，步骤(2)所述吸附剂颗粒为c18吸附剂颗粒。14.优选地，步骤(2)将步骤(1)获得的衍生化后的提取液固液分离后得到的液相与氯化钠和吸附剂颗粒充分混合，其中混合时向所述液相中加入氯化钠使其达到饱和，且每毫升所述液相中加入的吸附剂颗粒为0.02-0.1g。15.优选地，步骤(2)将步骤(1)获得的衍生化后的提取液固液分离后得到的液相与氯化钠和吸附剂颗粒采用涡旋进行充分混合，使得氯化钠溶解，利用氯化钠的盐析作用以及吸附剂颗粒的吸附作用对该衍生化后的提取液进行净化，静置分层后取下层水相，得到净化后的水相提取液。16.优选地，步骤(3)对步骤(2)获得的净化后的水相提取液中的草甘膦采用高效液相色谱或高效液相色谱质谱联用进行定性和定量分析。17.优选地，所述待测样品为土壤或沉积物。18.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：19.(1)本发明提出的一种草甘膦测定方法，在待测样品前处理过程中，通过采用具有ph缓冲特性的提取试剂，配合合适的衍生试剂，获得了一种提取和衍生同步进行的前处理方法，该方法与传统方法中的前处理过程相比，不仅将原有的提取和衍生分开进行的步骤同步完成，而且通过简单的分散固相萃取和盐析即可完成提取液的净化，避免了液液萃取净化时有机溶剂的使用或固相萃取小柱净化时繁琐的操作步骤，因此有效简化了样品前处理步骤，降低了样品制备过程中可能引入的人为误差，提高样品测定效率的同时方法更为准确和绿色环保。20.(2)本发明在样品原位衍生前处理后利用盐析现象，仅需加入少量的氯化钠盐，溶解后，即可实现衍生过程带来的溶剂乙腈与水相的分层，由于草甘膦衍生物更易进入水相，因此此过程不仅可以达到提取液净化的作用，也能提高目标物的富集倍数，得到更低的方法检出限，相比传统的氮吹浓缩富集技术而言，本方法操作更加简单，绿色。21.(3)本发明在样品提取步骤加入了c18吸附剂颗粒和简单的涡旋前处理，就可以完成提取液的净化；相比传统的净化步骤，不需要用昂贵的固相萃取小柱或使用有毒有害的有机试剂液液萃取净化，也减少了繁琐的前处理步骤带来的不可把控的人为因素，操作简单，减少了对环境二次污染的危害。22.(4)本发明将在线衍生技术、分散固相萃取技术和盐析技术相结合，对比《土壤和沉积物草甘膦的测定高效液相色谱法》(hj1055-2019)中样品前处理步骤，本发明通过在线衍生一步完成提取加衍生化步骤，利用盐析方法和c18吸附剂颗粒的吸附作用完成提取液的净化，以绿色高效方式完成土壤或沉积物中草甘膦前处理。本方法对比标准方法，减少了样品提取后需要：1.过滤，2.调节ph，3.过滤，4.有机溶剂萃取等繁琐的前处理步骤，操作流程更为简单；提高了批量样品前处理的效率，降低样品检测成本；也减少了大量有毒有害有机试剂的使用，本发明为测定土壤或沉积物中草甘膦提出了一种高效且准确、绿色的检测手段。23.(5)本发明可以有效简化前处理流程，节省人力和减少大量有机试剂的使用，在外界能量辅助的条件下进行在线衍生，能同时完成样品中草甘膦的提取和衍生；通过盐析作用和吸附剂分散固相萃取吸附，进一步提高目标物富集倍数和净化样品。本方法大大降低了前处理的难度，减少了有机试剂使用，降低了检测成本，提高前处理效率，可以成功用于环境土壤和沉积物中草甘膦的定量分析。附图说明24.图1为本发明实施例中草甘膦测定方法流程图。25.图2为实施例1草甘膦标准物质衍生产物色谱图。26.图3为实施例1基质样品经在线衍生后(未净化)直接测试的色谱图。27.图4为实施例1基质样品衍生后通过盐析作用和吸附剂分散固相萃取净化后的色谱图。28.图5为对比例4采用氢氧化钠水溶液作为提取试剂且其他条件同实施例1时得到的样品的色谱图。具体实施方式29.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。30.本发明提供的一种提取和衍生同步进行的草甘膦快速测定方法，包括如下步骤：31.(1)样品提取和衍生化：将待测样品和硅藻土混合后研磨得到混合样品，将其与四硼酸盐溶液和衍生试剂混合，进行在线提取和衍生，得到衍生化后的提取液；32.(2)分散固相萃取和盐析净化：将步骤(1)获得的衍生化后的提取液固液分离后得到的液相与吸附剂颗粒和氯化钠充分混合，利用吸附剂颗粒的吸附作用和氯化钠的盐析作用对该衍生化后的提取液进行净化，固液分离后得到净化后的水相提取液；33.(3)对步骤(2)获得的净化后的水相提取液中的草甘膦进行定性和定量分析。34.一些实施例中，步骤(1)将待测样品与硅藻土按照质量比1:2-2:1混合后研磨，制成流沙状混合样品。35.一些实施例中，步骤(1)所述衍生试剂为9-芴甲基氯甲酸酯的乙腈溶液，其中所述9-芴甲基氯甲酸酯的浓度为5-20g/l；所述四硼酸盐溶液的浓度为0.05-0.10mol/l，每克所述待测样品中加入的所述四硼酸盐溶液为2-5毫升；所述衍生试剂与所述四硼酸盐溶液的体积比为1:1-2:1。36.一些实施例中，步骤(1)将混合样品与四硼酸盐溶液和衍生试剂混合，在震荡、搅拌或超声条件下进行在线提取和衍生，提取和衍生时间为1-2小时。37.一些实施例中，步骤(2)所述固液分离为涡旋或离心分离。较佳实施例中，步骤(2)采用涡旋即可实现分层。步骤(2)所述吸附剂颗粒为c18吸附剂颗粒。38.一些实施例中，步骤(2)将步骤(1)获得的衍生化后的提取液固液分离后得到的液相与氯化钠和吸附剂颗粒充分混合，其中混合时向所述液相中加入氯化钠使其达到饱和，且每毫升所述液相中加入的吸附剂颗粒为0.02-0.1g。39.一些实施例中，步骤(2)将步骤(1)获得的衍生化后的提取液固液分离后得到的液相与氯化钠和吸附剂颗粒采用涡旋进行充分混合，使得氯化钠溶解，利用氯化钠的盐析作用以及吸附剂颗粒的吸附作用对该衍生化后的提取液进行净化，静置分层后取下层水相，得到净化后的水相提取液。40.一些实施例中，步骤(3)对步骤(2)获得的净化后的水相提取液中的草甘膦(以草甘膦衍生物形式)采用高效液相色谱或高效液相色谱质谱联用进行定性和定量分析检测。41.一些实施例中，本发明采用高效液相色谱检测时的液相色谱条件：pahs专用分析柱250mm×4.6mm，5μm不锈钢柱；流动相a(0.3％磷酸水溶液)，流动相b(乙腈)；流速：0.8ml/min；柱温：30-40℃；进样量：20μl。42.本发明提出的草甘膦的快速测定方法，适用于土壤和沉积物中草甘膦的测定，也即国标hj1055-2019的适用对象也均适用于本发明。43.本发明在实验过程中尝试了多种提取试剂，以期实现提取和衍生的同步进行。比如分别尝试过氢氧化钠水溶液、氨水溶液、柠檬酸钠溶液及其他具有络合功能的盐类，与衍生试剂一起与待提取样品混合，然而，采用这些提取试剂时，要么根本不能进行衍生，无法实现提取和衍生的同步操作；要么可以衍生，但是衍生得到的不是草甘膦而可能是其降解产物的衍生物。分析其中的原因，可能是以上提取试剂仅能提供碱性环境但不具备ph缓冲特性，当耦合衍生过程时，衍生剂9-芴甲基氯甲酸酯水解副反应会产生大量氢离子，降低体系的ph，随着ph的降低，不适合草甘膦衍生反应的进行。比如以高浓度氢氧化钠(0.1mol/l)作为提取试剂，随着反应的进行，最终体系也会变成酸性(ph为2)；虽然柠檬酸盐体系具备ph缓冲特性，但其缓冲ph范围为3.0-6.6，随着反应的进行，体系ph依然会降低，影响草甘膦衍生反应的进行。与其他提取试剂不同，本发明采用四硼酸盐比如四硼酸钠作为提取试剂，可能是由于其本身作为9-芴甲基氯甲酸酯进行草甘膦衍生的溶剂得到广泛使用，同时能够提供草甘膦提取所需的碱性环境；与此同时，四硼酸盐本身具有一定的络合能力，能够消除金属离子干扰，从而提高衍生提取的效率。44.在线衍生是指提取过程和衍生过程同时进行，也称原位衍生。本发明测定土壤和沉积物中的草甘膦，前处理中的提取和衍生同步进行，即前处理过程为在线衍生。该过程之所以能够实现可能主要得益于四硼酸盐既可以作为提取试剂，也能够为衍生反应提供适宜的ph“微环境”，然而在实验中也发现，提取试剂与衍生试剂用量不匹配时，也无法实现在线衍生。究其原因可能主要在于两方面：一是四硼酸盐的加入多以水溶液形式进行，在固定浓度下加入量的多少决定了引入体系的水分多少，水分的过多引入不可避免会促进衍生剂9-芴甲基氯甲酸酯的水解；二是9-芴甲基氯甲酸酯的加入多以乙腈溶液形式进行，乙腈的存在主要是促进9-芴甲基氯甲酸酯的溶解，在固定浓度下加入量的多少决定了引入体系的乙腈多少，乙腈的引入不足难以保证9-芴甲基氯甲酸酯的溶解。不管是9-芴甲基氯甲酸酯的水解还是难以溶解，均会抑制体系衍生反应的高效进行。在提取衍生分步进行时，一般几百毫升的衍生试剂中仅加入很少量的四硼酸钠溶液即可满足衍生反应的要求，然而，本发明进行在线衍生，实验发现提取试剂和衍生试剂的体积比需在1:2-1:1的范围内才能保证衍生反应的顺利进行即实现在线衍生。上述配比条件下溶剂水和乙腈的比例相对于国标hj1055-2019中的用量大幅度提升，为后续通过盐析作用净化衍生提取液提供了良好的条件。45.本发明对在线衍生得到的衍生化后的提取液进行净化处理时，无需如传统方法那样通过有机试剂萃取，或小柱净化，而是加入饱和的氯化钠和吸附剂颗粒，利用氯化钠的盐析作用和吸附剂颗粒的吸附作用对该衍生化后的提取液进行净化，经过简单涡旋后静置分层，目标产物在水相，净化的同时提高富集倍数。46.实施例147.(1)样品提取步骤：称取2g(以干重记)样品，加入1g的硅藻土，充分混匀研磨至流沙状；转移至干净的50mlpp离心管中，加入10ml浓度为0.05mol/l的四硼酸钠水溶液和20ml浓度为10g/l的9-芴甲基氯甲酸酯的乙腈溶液，盖好离心管并拧紧，通过超声仪辅助在线衍生1h。48.(2)盐析作用和吸附剂颗粒净化：将上述装有提取液的离心管置于离心机高速离心至固液分离；取10ml上清液并加入0.3g氯化钠和1.0gc18吸附剂颗粒于12ml的离心管中；涡旋2min待盐溶解后，静置立刻分层；取下层水相过滤至样品小瓶中，上机测试。49.(3)分析测试步骤：采用高效液相色谱联用荧光检测器进行上述样品的测试。上述检测的液相色谱条件：pahs专用分析柱250mm×4.6mm，5μm不锈钢柱；流动相a(0.3％磷酸水溶液)，流动相b(乙腈)；流速：0.8ml/min；柱温：35℃；进样量：20μl。表1为高效液相色谱梯度洗脱条件，表2为荧光检测器波长选择条件。50.表1高效液相色谱梯度洗脱条件[0051][0052]表2荧光检测器波长选择条件[0053][0054]取适量草甘膦标准使用液，用超纯水稀释成线性范围1-200μg/l的标准系列，按照样品相同的步骤进行前处理。以草甘膦的质量浓度(c)为横坐标，以其衍生物的峰面积(a)为纵坐标，得线性回归方程为a＝57359.0729×c，相关系数为0.9998，表明草甘膦在1-200μg/l的质量浓度范围内与其衍生化产物对应的荧光响应峰面积线性关系良好。根据《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(hj168-2020)的规定，通过本方法连续测定7个接近于方法检出限的0.05mg/kg的浓度样品，考察了本方法的检出限，根据本研究方法测定所得的方法检出限为0.019mg/kg，通过4倍检出限换算得到方法定量下限为0.076mg/kg；并选取了实际土壤基质进行加标回收试验，添加的质量浓度分别为0.05、0.10和0.50mg/kg，每个样品制备6个平行样品，所测定结果的回收率和相对标准偏差结果如表3所示。由表3可知，此方法的草甘膦加标回收率在83.0％-99.0％之间，测定结果的相对标准偏差在10.5％-12.9％之间，方法的准确度和精密度能够满足实际样品测定的需求。相比传统方法而言，本发明方法高效、准确、绿色，适宜于实际大批量样品分析检测。[0055]表3加标回收试验结果[0056]table3resultsoftestsforrecovery[0057][0058]图1为本发明实施例中草甘膦测定方法流程图。[0059]图2为实施例1草甘膦标准物质衍生产物色谱图，可以看出衍生产物的峰型尖锐对称，衍生副产物的干扰小。[0060]图3为实施例1基质样品经在线衍生后(未净化)直接测试的色谱图，可以看出衍生副产物的峰响应过强，会降低荧光检测器使用寿命，并且严重干扰草甘膦的分析定量。[0061]图4为实施例1基质样品衍生后通过盐析作用和分散固相萃取吸附剂净化后的色谱图，与图3对比可以看出衍生副产物得到有效的去除，净化效果较好。[0062]对比例1[0063]其他条件同实施例1，不同的是，以10ml浓度为1g/l的磷酸二氢钾水溶液和20ml浓度为10g/l衍生试剂9-芴甲基氯甲酸酯的乙腈溶液进行在线衍生，实验发现，即使以空白基体石英砂进行加标实验，草甘膦衍生物出峰位置仍有强烈干扰，导致此方法无法完成定性定量分析。[0064]对比例2[0065]其他条件同实施例1，不同的是以10ml浓度为0.5mol/l氨水与20ml浓度为10g/l衍生试剂9-芴甲基氯甲酸酯的乙腈溶液进行在线衍生，实验发现，以石英砂为基质进行加标实验时，具有较好的衍生效果，但是在进行实际土壤样品加标实验时，衍生无法进行，产物回收率为0，表明此条件不行。[0066]对比例3[0067]其他条件同实施例1，不同的是以10ml浓度为0.05mol/l氢氧化钠水溶液与20ml浓度为10g/l衍生试剂9-芴甲基氯甲酸酯的乙腈溶液进行在线衍生，实验发现，其衍生后的体系为强酸性(ph《3)环境，实际样品中衍生效率为0，无法进行。[0068]对比例4[0069]其他条件同实施例1，不同的是以0.05mol/l氢氧化钠水溶液与20ml的浓度为10g/l衍生试剂9-芴甲基氯甲酸酯的乙腈溶液进行在线衍生，并且加入适量的psa作为分散固相萃取吸附剂，实验发现，在碱性环境下，psa的引入容易导致草甘膦降解，结果如图5所示，表明psa不适合作为分散固相萃取的吸附剂。[0070]对比例5[0071]其他条件同实施例1，不同的是以10ml浓度为0.05mol/l柠檬酸钠水溶液与20ml浓度为10g/l衍生试剂9-芴甲基氯甲酸酯的乙腈溶液进行在线衍生，实验发现，反应所得并非草甘膦的衍生产物，同时伴有其他干扰峰的存在，此条件不适合在线衍生。[0072]对比例6[0073]其他条件同实施例1，不同的是在10ml浓度为0.05mol/l的四硼酸钠溶液与20ml浓度为10g/l的衍生试剂9-芴甲基氯甲酸酯的乙腈溶液在线衍生体系中，分别加入适量的hc-c18和lc-c18作为分散固相萃取吸附剂，实验发现，引入hc-c18和lc-c18吸附剂的回收率结果均有降低，说明c18材料直接引入在线衍生过程，会吸附或者络合草甘膦，导致衍生化不完全。[0074]对比例7[0075]其他条件同实施例1，不同的是改变0.05mol/l的四硼酸钠溶液与10g/l的衍生试剂9-芴甲基氯甲酸酯的乙腈溶液的体积比，实验发现，当二者比例高于1：1时，随着比例增高，草甘膦衍生产物的回收率有降低和不能衍生的趋势，说明此溶剂比例的条件下，衍生效果较差。[0076]本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12