基于CRISPR-Cas12a体系检测真菌毒素的方法与流程

本发明涉及电化学分析检测领域，具体涉及一种基于crispr-cas12a体系检测真菌毒素的方法。

背景技术：

1、赭曲霉毒素a(ota)是食品中最常见的污染性霉菌毒素之一，毒性最大，能够引起肝脏、肾脏损伤以及神经和免疫损伤，也是致癌物质之一。人类暴露于ota主要是通过食用储存不当的食品，特别是受污染的谷物。同时由于ota具有较高的物理和化学稳定性，因此当食品被ota污染时，在正常烹饪条件下(如高温)几乎不可能完全降解。所以，一旦人体摄入受ota污染的食品，容易造成ota在人体内长期残留蓄积，可能对生命和健康造成不可逆转的毒害作用。正是由于ota毒素在各种食品基质中的普遍存在性，欧盟委员会对各种食品中ota的允许限量进行了监管，如谷物(5μg/kg)、葡萄酒(2μg/kg)和葡萄汁(2μg/kg)。在这种情况下，食品中痕量ota的检测就显得尤为重要。目前，许多方法包括高效液相色谱法、质谱法、荧光法、表面增强拉曼散射法和比色法已被用于ota检测。虽然这些方法精度相对较高，但往往需要复杂的操作和昂贵的仪器，并且存在在复杂食品基质中适用性差等问题。考虑到ota的高毒性和存在的复杂食品基质，ota检测需要更高的特异性和灵敏度。因此，迫切需要建立一种稳健、准确、适用性强、超灵敏的食品中ota检测方法。

2、在过去的几年中，成簇的规则间隔短回文重复序列(crispr)和其相关(cas)系统蛋白的发现和发展不仅在基因编辑领域取得了革命性的进展，而且在其他领域也产生了深远的影响。cas12a是属于crispr-cas效应子家族中的一类系统，在识别其相应的rna(crrna)后，cas12a蛋白不仅具有靶向切割双链dna和单链dna(ssdna)的顺式切割能力，而且还具有反式切割周围任意ssdna的侧链切割活性。利用上述特性，crispr-cas12a已被用于开发许多分子诊断策略，如基于crispr-cas12a的核酸传感器sherlock和detectr。此外，根据检测目标的不同，基于crispr-cas12a的诊断方法已经从核酸扩展到非核酸目标，如生物酶检测、生物标志物、金属离子检测和小分子检测。根据传感器类型，crispr-cas12a生物传感器主要包括荧光传感器，比色传感器和电化学传感器。然而，大多数基于crispr-cas12a的生物传感器基于传统的荧光猝灭探针，易于氧化，灵敏度低，必须避光，并不利于实际应用。考虑到crispr-cas技术在食品检测领域尚未得到充分利用，并且由于食品基质的复杂性和食品相关检测所需的高灵敏度，迫切需要该技术。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的生物传感器灵敏度有待提高的问题，提供一种检测真菌毒素的方法，该方法具有较高的灵敏度和较高的选择性，且操作简单快速。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种基于crispr-cas12a体系检测真菌毒素的方法，包括如下步骤：

3、(1)将单链dna与真菌毒素的识别dna进行反应i得到单链-识别dna复合物，所述单链dna为与识别dna互补的dna；

4、(2)将所述单链-识别dna复合物与可能含有真菌毒素的待测样品混合进行反应ii后，与含有激活dna片段的辅助dna混合进行反应iii得到反应混合物i，将所述反应混合物i与辅助酶混合进行反应iv得到可能含有所述激活dna的反应混合物ii，所述辅助dna为与所述单链dna互补的dna；

5、(3)将所述反应混合物ii与crispr-cas12a体系溶液混合活化后得到反应液；

6、(4)将步骤(3)得到的反应液滴加至电化学生物传感器进行反应v，待所述反应v结束后检测所述电化学生物传感器的电化学信号；

7、其中，所述辅助dna能够与所述单链dna结合形成单链-辅助dna复合物，所述辅助酶能够消化所述单链-辅助dna复合物释放所述激活dna。

8、优选地，所述真菌毒素为霉菌毒素。

9、进一步优选地，所述霉菌毒素为赭曲霉毒素a，所述单链dna的核苷酸序列如seqid no.1所示，所述识别dna的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述辅助dna的核苷酸序列如seq id no.3所示。

10、优选地，在步骤(1)中，所述识别dna和所述单链dna的摩尔比为1:1.25-1.75。

11、进一步优选地，所述反应i的条件包括：温度为90-98℃，时间为3-8min。

12、优选地，在步骤(2)中，相对于1mol的单链dna，所述辅助dna的添加量为1-1.2mol。

13、进一步优选地，在步骤(2)中，所述反应ii的条件包括：温度为30-45℃，时间为60-90min；

14、所述反应iii的条件包括：温度为30-45℃，时间为30-60min。

15、优选地，在步骤(2)中，所述辅助酶能够消化所述单链-辅助dna复合物释放所述激活dna和所述单链dna，优选为exo iii酶。

16、优选地，所述反应混合物ii含有所述单链dna时，所述方法还包括：在所述反应混合液ii中，将可能含有的所述单链dna继续反应iii。

17、优选地，在步骤(3)中，所述crispr-cas12a体系溶液含有crrna、cas12a蛋白、核糖核酸酶抑制剂和缓冲剂；其中，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述激活dna的核酸序列如seq id no.4所示。

18、优选地，在步骤(3)中，所述活化的条件包括：温度为30-45℃，时间为20-30min。

19、优选地，所述电化学生物传感器包括电极和修饰在所述电极上的功能层，所述功能层含有聚丙烯胺盐酸盐、二氧化铈以及二茂铁标记的非特异性单链dna。

20、进一步优选地，所述聚丙烯胺盐酸盐、所述二氧化铈以及所述二茂铁标记的非特异性单链dna的摩尔比为1×104-2×104:1.5×103-4×103:1。

21、更优选地，所述非特异性单链dna的核苷酸序列如seq id no.6所示。

22、优选地，所述电极为玻碳电极、金电极或铂电极。

23、优选地，所述方法还包括：在步骤(4)前，检测电化学生物传感器的初始电化学信号，并计算出所述电化学信号与所述初始电化学信号的差值百分比。

24、通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

25、(1)本发明提供的方法，具有较好的检测特异性和较高的灵敏度，在1×10-6-5ng/ml范围内具有良好的线性关系，其最低检出限为0.74fg/ml，检测结果准确可靠。

26、(2)本发明提供的方法，操作简单不需要复杂仪器，cas12a作用温度为37℃，不需要复杂的变温条件，因此对仪器要求不高，而且容易操作。

27、(3)本发明提供的方法，不仅适用于食品中赭曲霉毒素a的检测，在其他真菌毒素的检测中同样具有巨大应用潜力。

28、(4)本发明采用exoⅲ酶后，单链-辅助dna能够在exo iii酶的作用下释放单链dna，该单链dna可以继续与辅助dna反应形成单链-辅助dna，形成的单链-辅助dna能够继续与exo iii酶作用，实现单链dna的循环，从而提高单链dna的利用率，而且能够产生大量与crispr-cas12a体系中的crrna结合的激活dna，放大crispr-cas12a的反式切割效率，提高切割后电化学生物传感器中信号探针产生的信号强度，可以有效增加检测的灵敏度，通过电化学信号响应变化值定量的分析样品中的赭曲霉毒素a。