一种核酸适配体电化学传感器的制备方法及其应用

本发明涉及电化学分析检测，具体涉及一种核酸适配体电化学传感器的制备方法及其应用。

背景技术：

1、展青霉素(patulin，pat)，一种强毒性的真菌代谢产物，普遍存在于腐烂的蔬菜、水果中，是对人类危害最大的真菌毒素之一，具有影响生育、致癌和致畸等毒理作用，可导致呼吸和泌尿等系统的损害，严重者出现神经麻痹、肺水肿及肾功能衰竭等症状，对人体健康构成威胁。因此，建立简单、准确、灵敏的展青霉素分析检测方法，对果蔬的加工、运输和保存具有重要意义。

2、展青霉素的分析方法主要有：高效液相色谱法、高效液相色-谱串联质谱法、薄层色谱法、气相色谱-质谱和毛细管电泳法等。但这些方法均有样品前处理繁琐、使用的有机试剂毒性大、仪器运行成本高、分析时间长等缺点。电化学法因响应速度快、操作简单、成本低、易于微型化等优点而被广泛应用，但传统的展青霉素分子印记电化学传感器制备过程复杂，灵敏度低，吸附容量小，洗脱困难，难以满足组分复杂样品中低含量展青霉素的检测需求。因此建立简单、快速、选择性好、灵敏度高的新型展青霉素电化学传感器迫在眉睫。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种核酸适配体电化学传感器的制备方法，旨在得到检测展青霉素灵敏度高、选择性好、检测结果准确的核酸适配体电化学传感器。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

3、一种核酸适配体电化学传感器的制备方法，包含以下操作步骤：

4、(1)合成多孔碳材料(sa-c)；

5、(2)取步骤(1)的多孔碳材料(sa-c)在浓酸下回流制备羧基功能化多孔碳材料(sa-c-cooh)；

6、(3)核酸适配体电化学传感器的构建：将步骤(2)中的羧基功能化多孔碳材料(sa-c-cooh)制备成羧基功能化多孔碳(sa-c-cooh)悬浊液，滴于预处理后的玻碳电极表面，干燥后浸入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)混合液中活化羧基，冲洗、干燥，得到act/sa-c-cooh/gce修饰电极，滴核酸适配体溶液，孵育，得到aptamer/act/sa-c-cooh/gce修饰电极，冲洗、干燥；将干燥后的aptamer/act/sa-c-cooh/gce修饰电极浸泡在牛血清蛋白(bsa)溶液中封闭，冲洗、干燥，得到bsa/aptamer/act/sa-c-cooh/gce，即为核酸适配体电化学传感器；

7、其中，所述核酸适配体溶液中的核苷酸序列为：5’-nh2-(ch2)6-cagctcagaagcttgatcct-ggcccgccaacccgcatca tctacactgatattttacctt-gactcgaagtcgtgcatctg-3’。

8、进一步的，步骤(1)中所述合成多孔碳材料(sa-c)为将海藻酸钠在惰性气体保护下升温至700-900℃保持1-2h，自然冷却至室温，将所得黑色固体分别用hcl溶液和水洗涤，过滤，即得多孔碳材料(sa-c)。

9、进一步的，海藻酸钠20g在惰性气体保护下，升温程序为5℃/min，升温至800℃保持1.5h，所述hcl溶液的摩尔浓度为5mol/l；所述的惰性气体为氩气。

10、进一步的，步骤(2)为取步骤(1)的多孔碳材料(sa-c)，加入浓h2so4和浓hno3混合液回流1-3h，冷却到室温，将所得固体经水洗，8000r/min离心5min，收集产物于75℃干燥，即得羧基功能化多孔碳材料(sa-c-cooh)。

11、进一步的，所述浓h2so4和浓hno3混合液中浓h2so4和浓hno3的体积比为3:1，浓h2so4和浓hno3混合液的体积为100ml，多孔碳材料的质量为0.5g，所述回流时间为2h，回流温度为60℃。

12、进一步的，步骤(3)中所述的冲洗皆为采用三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)缓冲液冲洗，所述三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)缓冲液的摩尔浓度为10mmol/l，ph值为7.4；步骤(3)中所述的干燥皆为红外灯下烤15min。

13、进一步的，步骤(3)中将步骤(2)中的羧基功能化多孔碳材料(sa-c-cooh)于水中超声分散，制备得到均匀稳定质量浓度为1.0mg/ml的羧基功能化多孔碳(sa-c-cooh)悬浊液，电极的修饰量为6μl。

14、进一步的，步骤(3)中所述预处理后的玻碳电极为将玻碳电极(gce)用氧化铝抛光成镜面，依次用hno3溶液、乙醇和超纯水超声清洗，自然干燥后即得。

15、进一步的，步骤(3)中所述预处理后的玻碳电极为将玻碳电极(gce)分别用粒径为0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光成镜面；所述hno3溶液中的硝酸(hno3)与水的体积比为1:1；所述的乙醇为无水乙醇。

16、进一步的，步骤(3)中浸入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)混合液中10-60min活化羧基；所述1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)混合液中，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的摩尔浓度均为0.5mol/l。

17、进一步的，步骤(3)中所述的孵育为30-40℃孵育1.5-3h；步骤(3)中所述封闭的时间为10-60min。

18、进一步的，步骤(3)中所述核酸适配体溶液的摩尔浓度为6μmol/l；所述孵育为37℃孵育2.5h；所述牛血清蛋白(bsa)溶液的浓度为0.5％，所述封闭的时间为30min。

19、本发明方法制备得到的核酸适配体电化学传感器用于检测展青霉素，检测展青霉素的方法包括以下步骤：

20、步骤s1，以所述核酸适配体电化学传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极，组成三电极系统；

21、步骤s2，制备不同浓度的展青霉素标准溶液，将所述核酸适配体电化学传感器分别浸入不同浓度的展青霉素标准溶液中进行特异性结合，然后将三电极系统插入到含[fe(cn)6]3-/4-和kcl的混合溶液中，在-0.10-0.50v范围内进行差分脉冲伏安扫描，记录在0.160±0.01v的电流值，通过dpv曲线计算核酸适配体电化学传感器跟展青霉素特异性结合前后的电流差值δi，根据δi值与展青霉素浓度的对数得到标准曲线和线性方程；

22、步骤s3，在实际检测样品中的展青霉素时，将核酸适配体电化学传感器浸入待测样中进行特异性结合，并根据特异性结合前后在含[fe(cn)6]3-/4-和kcl的混合溶液中测得0.160±0.01v的电流值计算出电流差值δi，将电流差值δi代入线性方程中，就可以计算出待测样品中的展青霉素浓度值。

23、进一步的，步骤s2所述的展青霉素标准溶液浓度分别为：0.0ng/l、0.5ng/l、1ng/l、10ng/l、100ng/l、1000ng/l、10000ng/l、100000ng/l、500000ng/l、1000000ng/l、5000000ng/l。

24、进一步的，步骤s2中的线性方程为y＝4.8137x+5.3212，相关系数r2＝0.9972；其中y为展青霉素与核酸适配体电化学传感器特异性结合前后的电流差值δi，x为展青霉素浓度的对数(ng/l)。

25、进一步的，步骤s2和步骤s3的特异性结合时间为75min。

26、进一步的，步骤s2和步骤s3中含[fe(cn)6]3-/4-和kcl的混合溶液中的[fe(cn)6]3-/4-摩尔浓度为5mmol/l，kcl的摩尔浓度为0.1mol/l。

27、与现有技术相比，本发明的有益效果：

28、(1)本发明方法采用玻碳电极作为基底，首次将羧基功能化多孔碳材料sa-c-cooh应用于展青霉素电化学适配体传感器的制备中，该传感器制作方便、简单、灵敏度高、特异性强、稳定性好、成本低；

29、(2)本发明基于多孔碳材料比表面积大、导电性好、生物相容性高及核酸适配体生物识别性高、亲和力强的特性，显著提高了传感器电流信号的强度和稳定性，提高了传感器的检测灵敏度和选择性；

30、(3)本发明的核酸适配体电化学传感器跟展青霉素特异性结合前后的电流差值与展青霉素浓度的对数在0.5-5000000ng/l范围内呈良好线性关系，检测灵敏度高，选择性好，检测结果准确。