一种适用于远航环境的通用型食源性致病菌检测方法

本发明涉及检测，具体地说，是一种适用于远航环境的通用型食源性致病菌检测方法。

背景技术：

1、目前食源性致病菌引起的各种疾病一直是人们关注的主要问题。找出病因并进行诊断是公共卫生和临床医学的重要任务。虽然当前国内外开展了许多以食源性致病菌检测为代表的相关研究，但应用在远海环境还存在许多不足之处。海上环境特殊，高温、高湿和高盐等因素都会对检测结果产生影响。以现今常采用的富集法细菌检测技术为例，这种方法的准确性较高，但至少需要4-7天才能得到正确的结果。其他方法，如依赖抗原抗体反应的elisa技术则容易受到环境影响。一般的检测方法在高温潮湿或含盐量较大的环境时，更容易对检测结果造成严重影响。并且食源性致病菌的存在环境多样且复杂，因此，研发复杂远航环境中的食品安全快速检测技术是目前急需解决的重点问题。

2、在食源性致病菌检测方面，由于电化学检测方法的高灵敏度、易操作、便携度高和低成本等优点，越来越引起人们的关注，其中主要包括基于抗体、酶、适配体的生物传感器。对于多种污染物检测，通常需要设计两个或更多的检测方法，因此针对多种食源性致病菌的通用型检测方法值得进一步研究。并且海上环境特殊，高温、高湿和高盐等因素都会对传感器的性能产生影响，针对上述环境下食源性致病生物传感器的研发还未见报道。

3、适配体(aptamer)是一种可以与目标物特异性结合的核酸序列，在电化学检测方面常用作捕获目标物的探针。目前其合成方式已经十分成熟，且合成价格低廉，在许多电化学策略下的食源性致病菌检测方面已经逐渐取代抗体。过去几年中用于提高电化学信号的一些材料是金属离子(例如，cd2+、pb2+、zn2+和cu2+)、亚甲基蓝、二茂铁等，这些材料常被修饰在适配体上，用于提供电化学检测信号。目前大多数研究中，一条适配体只修饰一个分子数量的信号材料，因此如何在常规检测方法的基础上进行改进和创新，具有一定的研究意义。

4、金属-有机框架材料(mofs)是近二十年来发展迅速的一种配位聚合物，具有三维的孔结构，一般以金属离子为连接点，有机配位体支撑构成空间3d延伸，是一类新型多孔材料，在催化、储能和分离中都有较好应用。其优秀的稳定性及吸附能力为电化学检测体系提供了研究价值。其中mofs材料uio-66是以含zr(iv)的金属簇为无机节点，以羧酸类为有机配体合成的金属有机骨架，具有良好的抗酸性，热稳定性，且易功能化修饰的特点被广泛关注。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种适用于远航环境的通用型食源性致病菌检测方法，是一种用于灵敏检测鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、大肠杆菌(escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的通用型电化学检测方法。

2、本发明的方法将负载亚甲基蓝的uio-66作为信号放大探针，适配体通过与uio-66的连接构成识别探针。在目标细菌存在的情况下，探针上的适配体会与目标细菌特异性结合。由于细菌的体积一般在1μm以上，因此当使用0.45μm的过滤膜过滤时，过滤后滤液中的内容物即为未与细菌结合的识别探针。通过在丝网印刷电极上测定滤液中识别探针上亚甲基蓝的电化学信号，从而来定量检测细菌。目前适配体合成技术成熟，且制备成本低廉，本发明的方法只需替换目标细菌的适配体既可实现对不同食源性致病菌的通用型检测。本发明方法测试的鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的检出限分别为3cfu·ml-1、4cfu·ml-1和5cfu·ml-1，检测时间均为30min，同时满足特异性检测结果。另外本发明方法在牛奶、鸡蛋、蔬菜和虾等多种实际样品中也具有较好的检测能力。最后本发明检测方法构建的检测体系经过了高温、高湿下的盐雾测试，验证了其在高盐、高温、高湿中的稳定性。综上，本发明不仅保证了检测食源性致病菌的灵敏度、检测时间、便携性等特点，还提供了一个用于检测多种目标细菌的通用型检测方法。最后验证了复杂环境中本检测方法的稳定性。

3、基于以上技术方案，本发明提供一种适用于远航环境的通用型食源性致病菌检测方法，包括以下步骤：

4、(a)识别探针的制备：采用uio-66富集亚甲基蓝，并与目标细菌适配体进行结合，得到的uio-66/mb/aptamer同时作为信号放大和识别探针；

5、(b)将被测菌液与(a)中得到的识别探针溶液混合反应，采用滤膜进行分离，因目标细菌体积较大无法通过滤膜，得到的滤液中是未与细菌结合的探针；

6、(c)电化学检测：使用差分脉冲伏安法检测滤液中亚甲基蓝的电化学信号，通过检测信号变化实现细菌浓度的定量检测。

7、进一步的，所述的食源性致病菌为鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、大肠杆菌(escherichia coli)、或金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)。

8、进一步的，步骤(a)中识别探针的制备方法为：取1ml的uio-66材料与3ml 10mm亚甲基蓝溶液混合，放于26℃、160rpm的摇床中振荡过夜，离心5min，弃上清，用1ml超纯水重悬底部析出的沉淀，放于室温备用；将适配体于95℃水浴加热10min，之后立即冰浴10min，使用磷酸盐缓冲溶液(pbs)将目标细菌适配体(aptamer)稀释至2μm，以1:1的体积与上述溶液混合，将混合溶液放于37℃、160rpm的摇床中振荡过夜；用磷酸盐缓冲溶液冲洗去除未结合的适配体后，得到uio-66/mb/aptamer识别探针。

9、由于uio-66的高孔隙率可以大量富集亚甲基蓝(mb)，因此可以对电化学信号进行有效放大；而细菌适配体可以特异性识别细菌，适配体末端的磷酸盐基团与uio-66的中心金属zr形成zr-o-p强配位健，无需复杂表面修饰，与uio-66稳定结合。因此使用亚甲基蓝、uio-66和细菌适配体共同构建了电化学检测中的信号放大和识别探针。在目标细菌存在的情况下，识别探针通过适配体捕获目标细菌。本发明中只需替换目标细菌的适配体既可实现对目标食源性致病菌的特异性检测，满足了对食源性致病菌通用型检测的需求。目前将uio-66/mb/aptamer同时作为信号放大和识别探针的方法没有应用在食源性致病菌的电化学检测中，是本发明的特征所在。

10、进一步的，步骤(b)中所述的滤膜孔径为0.45μm。

11、本发明采用的滤膜孔径为0.45μm，可以过滤大部分常见的食源性致病菌。本发明实施例中选取了三种常见食源性致病菌，其中鼠伤寒沙门氏菌的体积大约在(0.6～0.9)×(1～3)μm；大肠杆菌的体积大约在0.5×(1～3)μm；金黄色葡萄球菌体积约在0.5～1μm。除此以外，大部分菌体体积均在0.45μm以上，因此满足体积要求的细菌均能采用膜过滤的方法进行测试。

12、进一步的，步骤(b)中取识别探针溶液，以1:1的体积与被测菌液混合，于37℃、160rpm的摇床中振荡30min，取出后使用1ml针筒抽取300μl所得溶液，并在针筒前端套上0.45μm孔径的滤网，推动针筒塞进行缓慢过滤，可得到约200μl的澄清蓝色溶液；取100μl该溶液均匀滴涂于丝网印刷电极表面后进行电化学检测。

13、进一步的，步骤(c)中用差分脉冲伏安法测试检测液在-0.6v～0v范围内的还原电流信号，根据所测得的还原电流值与对应的菌液浓度值绘制线性关系，得出线性方程。

14、本发明中电化学检测的滤液为未与细菌结合的带有亚甲基蓝的识别探针。当被测细菌浓度越低时，滤出的含亚甲基蓝探针的浓度越高，所得到的电化学信号越高。通过该反向检测策略实现了对低浓度细菌的高灵敏检测。说明本方法的通用型检测和高灵敏的检测特点。

15、本发明的第二方面，提供一种通用型食源性致病菌识别探针，是将负载亚甲基蓝的uio-66作为信号放大探针，细菌适配体通过与uio-66的连接构成识别探针。

16、进一步的，所述的识别探针的制备方法为：取1ml的uio-66材料与3ml10mm亚甲基蓝溶液混合，放于26℃、160rpm的摇床中振荡过夜，离心5min，弃上清，用1ml超纯水重悬底部析出的沉淀，放于室温备用；将适配体于95℃水浴加热10min，之后立即冰浴10min，使用磷酸盐缓冲溶液(pbs)将目标细菌适配体(aptamer)稀释至2μm，以1:1的体积与上述溶液混合，将混合溶液放于37℃、160rpm的摇床中振荡过夜；用磷酸盐缓冲溶液冲洗去除未结合的适配体后，得到uio-66/mb/aptamer识别探针。

17、本发明的第三方面，提供一种如上所述的识别探针在远航环境的通用型食源性致病菌检测中的应用。

18、本发明优点在于：

19、1、mofs材料uio-66具有易修饰、富集能力强的特点。常规使用亚甲基蓝作为电化学指示剂的细菌检测方法中，往往只在相应的识别探针上绑定一个分子数量的亚甲基蓝，因此所提高的电化学信号较低。本发明的检测方法基于uio-66结构的高孔隙率对亚甲基蓝进行了有效的富集，从而有效放大了检测信号，构建了检测体系中的信号放大探针；另一方面，利用适配体末端的磷酸盐基团与uio-66的中心金属zr形成zr-o-p强配位健，无需复杂表面修饰，适配体与uio-66稳定结合，形成uio-66/mb/aptamer，实现具有信号放大及目标识别双功能的检测探针的构建。

20、2、适配体合成容易且成本低廉，在本发明的检测方法中根据目标细菌的不同，只需替换与其对应的适配体既可实现对该细菌的识别检测，满足了对多种食源性致病菌通用型检测的需求。

21、3、本发明的检测方法采用了膜过滤法分离出了未与细菌结合的识别探针溶液。识别探针带有提供电化学信号的亚甲基蓝，亚甲基蓝的电流信号与被测细菌浓度呈负线性相关。当被测细菌浓度越低时，测试的电流信号越大。本方法可以有效提高对于低浓度样品的检出能力，大大增加检测方法的灵敏度。

22、4、本发明的检测方法经过了高温、高湿、高盐环境下的重现性和稳定性测试，结果证明本方法的重现性好，保存一周后的稳定性好，可以在盐雾环境下实现有效检测。另外还测试了在四种实际样品中对目标细菌的检测能力，结果证明检出能力较好，加标回收率和检测相对标准差均符合检测标准，证明本发明的检测方法可以在实现在复杂远航环境中对食源性致病菌进行快速、灵敏且稳定的检测。