一种检测槟榔中特异性N-亚硝基化合物的方法

本发明涉及食品分析领域，具体涉及一种检测槟榔中特异性n-亚硝基化合物的方法。

背景技术：

1、槟榔碱是槟榔中生物碱含量最高的活性物质。2020年《柳叶刀》将槟榔碱定为2b致癌物，槟榔碱被认定为槟榔疑似致癌的关键活性成分。而槟榔生物碱中含有仲胺和叔胺，在咀嚼槟榔时，通过硫氰酸盐作为亚硝化催化剂与亚硝酸盐反应，在唾液中进行亚硝化反应，生成多种槟榔特有的复杂n-亚硝基化合物，目前已知的有n-亚硝基去甲槟榔碱(n-nitrosoguvacoline，ngl)、n-亚硝基去甲槟榔次碱(n-nitrosoguvacine，ngc)、n-亚硝基异丙酸(n-nitrosonipecoticacid，nnip)、3-甲基亚硝胺丙腈

2、(3-methylnitrosaminopropionitrile，mnpn)和3-甲基亚硝胺丙醛(3-methylnitrosaminopropionaldehyde，mnpa)。这五种n-亚硝基化合物可以通过氧化应激与细胞内其他大分子相互作用，从而促进口腔癌变。

3、n-亚硝基化合物的仪器检测方法主要有气相色谱-热能分析仪法(gaschromatography-thermalanalyzer，gc-tea)、气相色谱-质谱联用(gaschromatography-massspectrometry，gc-ms)和液相色谱-串联质谱(liquidchromatographytandemmassspectrometry，lc-ms/ms)。但gc-tea的专用性太强，而且价格昂贵，一般实验室和检测中心很难配备；而gc-ms的分析检测时间较长。而液相色谱除了可以检测挥发性n-亚硝基化合物之外，也可以分析非挥发性n-亚硝基化合物；液相色谱结合质谱检测器能够在短时间内提供大量信息，而且其灵敏度和可重现性高，是检测n-亚硝基化合物的理想方法。但关于槟榔生物碱在口腔中亚硝化可能生成的n-亚硝基去甲槟榔次碱、n-亚硝基去甲槟榔碱、3-甲基亚硝胺丙腈、3-甲基亚硝胺丙醛和n-亚硝基异丙酸这五种n-亚硝基化合物仍未见有lc-ms/ms方法的建立。因此n-亚硝基去甲槟榔次碱、n-亚硝基去甲槟榔碱、3-甲基亚硝胺丙腈、3-甲基亚硝胺丙醛和n-亚硝基异丙酸的lc-ms/ms方法开发十分迫切，可以为槟榔碱疑似致癌性的机制研究提供有效的检测方法参考。

技术实现思路

1、要解决的技术问题：本发明提供了一种检测槟榔中特异性n-亚硝基化合物的方法，该检测方法具有灵敏度高、分析时间短、定量准确的优点，可以应用于槟榔致癌性的研究，尤其适用于含n-亚硝基去甲槟榔次碱、n-亚硝基去甲槟榔碱、3-甲基亚硝胺丙腈、3-甲基亚硝胺丙醛和n-亚硝基异丙酸的槟榔的致癌性研究。

2、技术方案：一种检测槟榔中特异性n-亚硝基化合物的方法，所述n-亚硝基化合物为n-亚硝基去甲槟榔碱、n-亚硝基去甲槟榔次碱、n-亚硝基异丙酸、3-甲基亚硝胺丙腈和3-甲基亚硝胺丙醛。

3、进一步的，采用超高效液相色谱质谱联用仪(uplc-ms/ms)进行检测，检测条件如下：

4、(1)液相色谱条件：

5、色谱柱：watersacquityuplchsst3色谱柱，2.1mm×100mm，1.7μm；

6、流动相：a：乙腈，b：0.1vt.％甲酸水溶液；

7、洗脱方式：梯度洗脱；

8、洗脱程序：0.00～0.50min，5vt.％a；0.50～3.50min，5～95vt.％a；3.50～4.00min，95vt.％a；4.00～4.50min，95～5vt.％a；4.50～5.00min，5vt.％a；

9、柱温：30℃；

10、样品室温度：10℃；

11、进样量：2μl；

12、流速：0.3ml/min；

13、(2)质谱条件：

14、质谱仪：三重四极杆质谱仪；

15、离子源：电喷雾离子源；

16、毛细管电压：1.50kv；

17、脱溶剂气-氮气温度：350℃；

18、脱溶剂气流量：1000l/h；

19、雾化器压力：6.2bar；

20、锥孔气流量：150l/h；

21、扫描方式：多反应检测模式；

22、质谱(mrm)参数：

23、

24、

25、表注：*为定量离子；3-甲基亚硝胺丙醛+2,4-二硝基苯肼为3-甲基亚硝胺丙醛衍生反应的反应产物。

26、进一步的，上述检测槟榔中特异性n-亚硝基化合物的方法，包括以下步骤：

27、(1)样品前处理：将3-甲基亚硝胺丙醛进行柱前衍生，衍生方法如下：取含3-甲基亚硝胺丙醛的样品液或标准溶液，加入同等体积的2,4-二硝基苯肼反应溶液，充分混匀反应，静置；(2)制备标准工作曲线：用甲醇将标准品储备液分别稀释成五个浓度梯度的n-亚硝基去甲槟榔碱、n-亚硝基去甲槟榔次碱、3-甲基亚硝胺丙腈和n-亚硝基异丙酸混合标准溶液和3-甲基亚硝胺丙醛+2,4-二硝基苯肼标准溶液，再经0.22μm尼龙滤膜过滤；

28、(3)采用lc-ms/ms进行分析，统计各个浓度下各物质的峰面积，以标准溶液的浓度为横坐标，定量离子的色谱峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，得到线性回归方程和拟合优度r2。进一步的，所述流动相b的配制方法为：取1.0ml色谱级甲酸，加超纯水定容至1000ml，即获得0.1vt.％甲酸水溶液，流动相使用前均需超声处理10min。

29、进一步的，所述步骤(1)中2,4-二硝基苯肼反应溶液的配制方法如下：量取20ml纯乙腈，加入0.4ml纯甲酸，制成含2vt.％甲酸的乙腈溶液；称取2,4-二硝基苯肼793mg，加入2ml含2vt.％甲酸的乙腈溶液，制成200mmol/l2,4-二硝基苯肼反应储备溶液，于4℃、避光、密封保存；使用时再用含2vt.％甲酸的乙腈溶液配制成所需浓度的2,4-二硝基苯肼反应溶液，现配现用。

30、进一步的，所述步骤(1)中3-甲基亚硝胺丙醛与2,4-二硝基苯肼反应的环境条件为黑暗环境、25℃，静置时间为1h。

31、进一步的，所述步骤(2)中3-甲基亚硝胺丙醛+2,4-二硝基苯肼标准工作曲线的配制方法如下：取0、1、2、5、10、20、50、100μmol/l3-甲基亚硝胺丙醛标准溶液，分别与同等体积的100μmol/l2,4-二硝基苯肼反应溶液衍生，充分混匀反应，静置；现配现用，不可贮存。

32、进一步的，所述步骤(2)中n-亚硝基去甲槟榔次碱、n-亚硝基去甲槟榔碱、3-甲基亚硝胺丙腈和n-亚硝基异丙酸混合标准溶液的浓度梯度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol/l，-20℃避光、密封可保存一周。

33、进一步的，所述步骤(3)中拟合优度r2至少达到0.99。

34、有益效果：

35、1.本发明建立了用uplc-ms/ms测定槟榔中特异性n-亚硝基化合物(n-亚硝基去甲槟榔碱、n-亚硝基去甲槟榔次碱、n-亚硝基异丙酸、3-甲基亚硝胺丙腈和3-甲基亚硝胺丙醛)的检测方法。

36、2.本发明利用uplc-ms/ms对5种特异性n-亚硝基化合物同时进行检测，提高了检测效率，节省了检测成本，同时具有灵敏度高、分析时间短、定量准确的优点。

37、3.本发明的检测方法可以应用于槟榔致癌性的研究，尤其适用于含n-亚硝基去甲槟榔次碱、n-亚硝基去甲槟榔碱、3-甲基亚硝胺丙腈、3-甲基亚硝胺丙醛和n-亚硝基异丙酸的槟榔的致癌性研究。