一种灵芝孢子粉药材的质量控制方法及其应用与流程

本发明涉及医药，具体涉及一种灵芝孢子粉药材的质量控制方法及其应用。

背景技术：

1、灵芝孢子是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞即灵芝的种子，其是目前中药制剂生产中常用的原料药材，但是其来源广泛，品种繁多，同一品种药材因其生长条件、采收季节、加工方式及贮藏条件的不同而在质量上存在差异，从而使中药制剂成品存在一定的质量差异。故有必要在药材进入中药制剂生产前对其重要质控指标进行快速检测和评价。

2、现有技术中未见将熵权topsis方法用于灵芝孢子粉药材中多个质控指标测定的相关报道。本方法在灵芝孢子粉药材质量快速分析领域具有重要前景和意义。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供了一种灵芝孢子粉药材的质量控制方法，该质量控制方法通过以下步骤实现：

2、(1)采集灵芝孢子粉原药材：采集不同批次灵芝孢子粉样本，经粉碎之后，得到粒度均匀的灵芝孢子粉药材粉末；(2)测定质控指标：测定灵芝孢子粉药材中粗多糖的得率、糖组成、总糖含量、蛋白含量和糖醛酸含量；以及(3)建立灵芝孢子粉药材各质控指标的定量分析模型和定量放行标准：采用熵权topsis方法建立定量评价模型，通过所建定量模型，建立以下定量放行标准：相对接近度ci＞0.5，完全满足定量放行标准的灵芝孢子粉药材判断符合定量要求，可放行进入原药材质量判别的下个环节。

3、进一步地，该灵芝孢子粉为破壁的灵芝孢子粉或未破壁的灵芝孢子粉。

4、进一步地，该粗多糖通过包括以下步骤的方法进行制备：

5、(1)称取适量的灵芝孢子粉药材粉末，加入8～12倍量90～100％乙醇浸泡0.2～2h，回流提取1～3h，回流完成之后，在4000～12000rpm下离心5～15min，药渣置于室温通风处晾干；(2)取晾干后的药渣加入8～12倍量水，煎煮提取1～3h，提取完成之后，在4000～12000rpm下离心5～15min，水提液备用，药渣再次加水提取，共计提取2～3次；(3)合并水提液，在55～65℃的温度下减压浓缩至相对密度为1.0～1.1，再加入90～100％乙醇，边加边搅拌，将乙醇浓度调至75～85％，2～6℃下放置12h以上，过滤，得到沉淀；以及(4)将该沉淀用适量的蒸馏水复溶，透析纸透析，截留分子量约10k，过夜，袋内截留液浓缩至适量，冷冻干燥，得到灵芝孢子粉粗多糖。

6、在本发明中，体积/质量之比、浓度、转速、时间、温度、压力、比例、当量、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“8～12”时，所描述的范围应被解释为包括范围“8～12”、“9～12”、“10～12”、“11～12”、“8～11”、“9～11”、“10～11”、“8～10”、“9～10”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

7、进一步地，该粗多糖通过包括以下步骤的方法进行制备：

8、(1)称取适量的灵芝孢子粉药材粉末，加入8～12倍量约95％乙醇浸泡约1h，回流提取约2h，回流完成之后，在10000rpm下离心10min，药渣置于室温通风处晾干；(2)取晾干后的药渣加入8～12倍量水，煎煮提取约2h，提取完成之后，在10000rpm下离心10min，水提液备用，药渣再次加水提取，共计提取2～3次；(3)合并水提液，在约60℃的温度下减压浓缩至相对密度为1.0～1.1，再加入约95％乙醇，边加边搅拌，将乙醇浓度调至约80％，约4℃下放置12h以上，过滤，得到沉淀；以及(4)将该沉淀用适量的蒸馏水复溶，透析纸透析，截留分子量约10k，过夜，袋内截留液浓缩至适量，冷冻干燥，得到灵芝孢子粉粗多糖。

9、进一步地，该得率＝该灵芝孢子粉粗多糖的质量/该灵芝孢子粉药材粉末的质量×100％。

10、进一步地，该粗多糖的糖组成的检测样品通过包括以下步骤的方法进行制备：

11、(1)称取适量的灵芝孢子粉粗多糖，加入1～2倍量的2mol/l的tfa溶液，充分混悬溶解，封口，在110～130℃下水解1.5～2.5h，取出，放冷至室温；(2)取适量水解后的样品于试管中，加入等体积的2mol/l的naoh溶液中和，再加入0.8～1.2ml 0.5mol/l nabh4的dmso溶液，混匀，于35～45℃的水浴中进行还原反应80～100min；(3)还原反应结束之后逐滴加入80～120μl冰醋酸，混匀，然后加入150～250μl 1-甲基咪唑和0.8～1.2ml乙酸酐，混匀，于35～45℃的水浴中进行乙酰化反应8～12min；以及(4)乙酰化反应结束之后加入1.5～2.5ml水溶液，摇匀，室温放置25～35min，加氯仿萃取乙酰化产物，氯仿层用水洗三次，用无水硫酸钠干燥，得到检测样品溶液。

12、进一步地，该粗多糖的糖组成的检测样品通过包括以下步骤的方法进行制备：

13、(1)称取适量的灵芝孢子粉粗多糖，加入约1.5倍量的2mol/l的tfa溶液，充分混悬溶解，封口，在约120℃下水解约2h，取出，放冷至室温；(2)取适量水解后的样品于试管中，加入等体积的2mol/l的naoh溶液中和，再加入约1ml 0.5mol/l nabh4的dmso溶液，混匀，于约40℃的水浴中进行还原反应约90min；(3)还原反应结束之后逐滴加入约100μl冰醋酸，混匀，然后加入约200μl 1-甲基咪唑和约1ml乙酸酐，混匀，于约40℃的水浴中进行乙酰化反应约10min；以及(4)乙酰化反应结束之后加入约2ml水溶液，摇匀，室温放置约30min，加氯仿萃取乙酰化产物，氯仿层用水洗三次，用无水硫酸钠干燥，得到检测样品溶液。

14、进一步地，该粗多糖的糖组成通过包括以下步骤的方法进行检测：取适量的该检测样品溶液，使用gc-ms进行检测，同时取标准单糖衍生化产物在相同条件下进行检测，对比样品与标准品的保留时间和质谱图，确定样品糖组成，并用面积归一化法确定各组分相对含量。

15、进一步地，该gc-ms进行检测的气相色谱条件如下所示：

16、柱子：hp-5ms，60m×0.25mm×0.25μm，agilent；程序升温：起始温度120℃，3℃/min升温至190℃，2℃/min升温至250℃，保温5min；进样体积：1μl；进样口温度：250℃；载气：he；载气流速：1.0ml/min；传输线温度：250℃。

17、进一步地，该各组分为甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

18、进一步地，该粗多糖的总糖含量的检测样品通过包括以下步骤的方法进行制备：称取适量的灵芝孢子粉粗多糖，加入约0.1倍量(体积/质量之比)的2m tfa溶液进行溶解，涡旋使其混合均匀，得到检测样品溶液。

19、进一步地，该粗多糖的总糖含量通过包括以下步骤的方法进行检测：

20、(1)将配制的该检测样品溶液，放入45～55℃水浴加热溶解0.8～1.2h之后取出；(2)加入适量的蒸馏水稀释，混合均匀；(3)取适量的混合均匀后的上清液于试管中，加入9倍体积的蒸馏水稀释10倍，涡旋混匀；(4)取适量的上述溶液，依次加入0.4～0.6倍体积的6％苯酚溶液、2.3～2.7倍体积浓硫酸，混匀，避光放置25～35min后测定490nm吸光度；以及(5)根据标准曲线回归方程计算样品中的总糖含量。

21、进一步地，该粗多糖的总糖含量通过包括以下步骤的方法进行检测：

22、(1)将配制的该检测样品溶液放入约50℃水浴加热溶解约1h之后取出；(2)加入适量的蒸馏水稀释，混合均匀；(3)取适量的混合均匀后的上清液于试管中，加入9倍体积的蒸馏水稀释10倍，涡旋混匀；(4)取适量的上述溶液，各管依次加入约0.5倍体积的6％苯酚溶液、约2.5倍体积浓硫酸，混匀，避光放置约30min后测定490nm吸光度；以及(5)根据标准曲线回归方程计算样品中的总糖含量。

23、进一步地，该粗多糖的蛋白含量的检测样品通过包括以下步骤的方法进行制备：称取适量的灵芝孢子粉粗多糖，加入约2倍量(体积/质量之比)的蒸馏水进行溶解，涡旋使其混合均匀，得到检测样品溶液。

24、进一步地，该粗多糖的蛋白含量通过包括以下步骤的方法进行检测：

25、(1)将蛋白标准液按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板中，加蒸馏水补足至20μl；(2)加入该检测样品溶液20μl于96孔板中；(3)各孔加入200μl工作液，振荡30s，盖住孔板，37℃下孵育30min，酶标仪562nm波长下比色测定，以蛋白含量μg为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线；以及(4)根据标准曲线回归方程计算样品中的蛋白含量。

26、进一步地，该粗多糖的糖醛酸含量的检测样品通过包括以下步骤的方法进行制备：称取适量的灵芝孢子粉粗多糖，加入约2倍量(体积/质量之比)的蒸馏水进行溶解，涡旋使其混合均匀，得到检测样品溶液。

27、进一步地，该粗多糖的糖醛酸含量通过包括以下步骤的方法进行检测：

28、(1)取适量的检测样品溶液，置1.5×15cm试管中，平行四份；(2)冰浴冷却下分别加入适量的四硼酸钠硫酸溶液，充分混匀；(3)沸水浴加热3～10min，取出，冰水浴冷却至室温；(4)其中三份加适量的0.15％间羟基联苯溶液，另一份加等体积的0.5％氢氧化钠溶液，混匀，静置10～20分钟至室温后测定520nm处吸光度；以及(5)根据标准曲线回归方程计算样品中的糖醛酸含量。

29、进一步地，该粗多糖的糖醛酸含量通过包括以下步骤的方法进行检测：

30、(1)取适量的检测样品溶液，置1.5×15cm试管中，平行四份；(2)冰浴冷却下分别加入适量的四硼酸钠硫酸溶液，充分混匀；(3)沸水浴加热约5min，取出，冰水浴冷却至室温；(4)其中三份加适量的0.15％间羟基联苯溶液，另一份加等体积的0.5％氢氧化钠溶液，混匀，静置约15分钟至室温后测定520nm处吸光度；以及(5)根据标准曲线回归方程计算样品中的糖醛酸含量。

31、进一步地，该定量模型的计算公式为ci＝[(得率×0.2844)2+(葡萄糖含量×0.0797)2+(甘露糖含量×0.0689)2+(半乳糖含量×0.1882)2+(总糖含量×0.1384)2+(糖醛酸含量×0.1079)2+(蛋白含量×0.1324)2]1/2/{[(0.284－得率×0.2844)2+(0.080－葡萄糖含量×0.0797)2+(0.069－甘露糖含量×0.0689)2+(0.188－半乳糖含量×0.1882)2+(0.138－总糖含量×0.1384)2+(0.108－糖醛酸含量×0.1079)2+(0.132－蛋白含量×0.1324)2]1/2+[得率×0.2844)2+(葡萄糖含量×0.0797)2+(甘露糖含量×0.0689)2+(半乳糖含量×0.1882)2+(总糖含量×0.1384)2+(糖醛酸含量×0.1079)2+(蛋白含量×0.1324)2]1/2}。

32、进一步地，该相对接近度ci＞0.55。

33、进一步地，在步骤(3)中，该熵权topsis方法建立定量评价模型的方法包括以下步骤：

34、(a)建立灵芝袍子粉药材质量的量化质控指标体系并构建灵芝袍子粉药材的批次集合；(b)确定该批次集合中每一灵芝袍子粉药材批次的质控指标值，形成原始数据矩阵；(c)对该原始数据矩阵进行归一化处理，构建归一化初始矩阵；(d)根据熵权法计算该归一化初始矩阵中各质控指标的权重；(e)根据该各质控指标的权重以及该归一化初始矩阵，构建归一化加权矩阵；以及(f)根据该归一化加权矩阵，采用topsis法对灵芝袍子粉药材的批次集合中的各批次灵芝袍子粉药材的优劣性进行排序，选出所有灵芝袍子粉药材批次中的最优灵芝袍子粉药材批次。

35、进一步地，在步骤(b)中，该原始数据矩阵的表达式为：

36、

37、在式(i)中，x为原始数据矩阵；xij为第i批灵芝袍子粉药材的第j个质控指标值，i＝1,2,3,...,m，j＝1,2,3,...,n；m为灵芝袍子粉药材批次集合中的灵芝袍子粉药材批次总数；n为量化质控指标体系中质控指标总数；xmn为第m批灵芝袍子粉药材的第n个质控指标值。

38、进一步地，在步骤(c)中，该归一化处理包括以下步骤：

39、对量化质控指标体系中各质控指标进行高优型和低优型两种类型的指标划分；

40、对于高优型指标，归一化处理方法为：

41、

42、对于低优型指标，归一化处理方法为：

43、

44、在式(ii)和式(iii)中，xij为原始数据矩阵的第i批灵芝袍子粉药材的第j个质控指标值；max(xij)为原始数据矩阵的第i批灵芝袍子粉药材的第j个质控指标的最大值；min(xij)为原始数据矩阵的第i批灵芝袍子粉药材的第j个质控指标的最小值；yij为归一化矩阵的第i批灵芝袍子粉药材的第j个质控指标值。

45、归一化处理后的归一化初始矩阵的表达式为：

46、

47、在式(iv)中，y为归一化初始矩阵；yij为归一化处理后的第i批灵芝袍子粉药材的第j个质控指标值；ymn为归一化处理后的第m批灵芝袍子粉药材的第n个质控指标值。

48、进一步地，在步骤(d)中，该熵权法计算归一化初始矩阵中各质控指标的权重包括以下步骤：

49、(i)根据该归一化初始矩阵，计算各质控指标下各药材占比的比重；(ii)根据该各质控指标下各药材占比的比重，计算各质控指标的熵值；以及(iii)根据各质控指标的熵值，计算各质控指标的权重；

50、其中，各质控指标下各药材占比的比重pij的计算公式如下：

51、

52、在式(v)中，yij为归一化初始矩阵的第i批灵芝袍子粉药材的第j个质控指标值，pij为各质控指标下各药材占比的比重；

53、第j个质控指标的熵值ej的计算公式如下：

54、

55、若pij＝0，则令pij lnpij＝0；

56、在式(vi)中，ej为第j个质控指标的熵值；m为药材批次集合中的药材批次总数；

57、第j个质控指标的权重wj的计算公式如下：

58、

59、在式(vii)中，wj为第j个质控指标的权重；n为量化质控指标体系中质控指标总数。

60、进一步地，在步骤(e)中，该构建归一化加权矩阵包括以下步骤：

61、对该归一化初始矩阵y中每一元素分别进行加权处理，得到归一化加权矩阵，该归一化加权矩阵的表达式为：

62、

63、其中，zij＝wj×yij

64、在式(viii)中，z为归一化加权矩阵；zij为归一化加权后的第i个灵芝袍子粉药材批次的第j个质控指标值；zmn为归一化处理后的第m个灵芝袍子粉药材批次的第n个质控指标值。

65、进一步地，在步骤(f)中，该采用topsis法对灵芝袍子粉药材的批次集合中的各批次灵芝袍子粉药材的优劣性进行排序包括以下步骤：

66、(α)根据该归一化加权矩阵，确定理论最优灵芝袍子粉药材批次z+和理论最劣灵芝袍子粉药材批次z-，(β)根据该最优灵芝袍子粉药材批次z+和该理论最劣灵芝袍子粉药材批次z-，分别计算灵芝袍子粉药材批次集合中各灵芝袍子粉药材批次与理论最优灵芝袍子粉药材批次、理论最劣灵芝袍子粉药材批次的接近程度；以及(γ)根据该各灵芝袍子粉药材批次与该理论最优灵芝袍子粉药材批次、该理论最劣灵芝袍子粉药材批次的接近程度计算出各灵芝袍子粉药材批次的应用效果综合评分，其中应用效果综合评分最高的灵芝袍子粉药材批次即为最优灵芝袍子粉药材批次。

67、进一步地，该理论最优灵芝袍子粉药材批次z+由归一化加权矩阵z中每列元素的最大值构成；

68、该理论最劣灵芝袍子粉药材批次z-由归一化加权矩阵z中每列元素的最小值构成；

69、该各灵芝袍子粉药材批次与该理论最优灵芝袍子粉药材批次z+的接近程度采用如下计算方法：

70、

71、在式(ix)中，di+为第i个灵芝袍子粉药材批次与理论最优灵芝袍子粉药材批次的接近程度；zj+为z+的第j个元素；zij为归一化处理后的第i个灵芝袍子粉药材批次的第j个质控指标值；

72、该各灵芝袍子粉药材批次与该理论最劣灵芝袍子粉药材批次z-的接近程度采用如下计算方法：

73、

74、在式(x)中，di-为第i个灵芝袍子粉药材批次与理论最劣灵芝袍子粉药材批次的接近程度；zj-为z-的第j个元素；

75、该各灵芝袍子粉药材批次的应用效果综合评分采用如下计算方法：

76、

77、在式(xi)中，ci为第i个灵芝袍子粉药材批次的应用效果综合评分；其中，0≤ci≤1，ci越接近1表示该灵芝袍子粉药材批次越优，应用效果综合评分最高的方案即为最优灵芝袍子粉药材批次。

78、进一步地，该质控指标为粗多糖的得率、葡萄糖含量、甘露糖含量、半乳糖含量、总糖含量、糖醛酸含量和蛋白含量。

79、进一步地，该高优型指标为粗多糖的得率、葡萄糖含量和总糖含量。

80、进一步地，该低优型指标为粗多糖的甘露糖含量、半乳糖含量、糖醛酸含量和蛋白含量。

81、进一步地，m＝11。

82、进一步地，n＝7。

83、根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述质量控制方法在灵芝袍子粉药材的质量评价和/或质量控制中的用途。

84、在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约95”包括95的±5％，或从90.25到99.75；“约2”包括2的±5％，或从1.9到2.1；“约1”包括1的±5％，或从0.95到1.05；“约60”包括60的±5％，或从57到63；“约80”包括80的±5％，或从76到84；“约4”包括4的±5％，或从3.8到4.2；“约1.5”包括1.5的±5％，或从1.425到1.575；“约120”包括120的±5％，或从114到126；“约40”包括40的±5％，或从38到42；“约90”包括90的±5％，或从85.5到94.5；“约100”包括100的±5％，或从95到105；“约200”包括200的±5％，或从190到210；“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5；“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5；“约0.1”包括0.1的±5％，或从0.095到0.105；“约50”包括50的±5％，或从47.5到52.5；“约0.5”包括0.5的±5％，或从0.475到0.525；“约2.5”包括2.5的±5％，或从2.375到2.625；“约15”包括15的±5％，或从14.25到15.75。

85、本发明的有益效果：

86、本发明的方法满足了灵芝孢子粉药材实际生产中快速、高效且准确的要求，具有生产药材筛选和质量全面评价的应用前景。