检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及流式细胞，具体涉及一种检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、肿瘤的形成与机体免疫系统息息相关，肿瘤伴随诊断因子是肿瘤相关细胞因子，常由免疫细胞产生，与传统肿标不同。肿瘤伴随诊断因子从免疫系统进行监测，弥补了传统肿瘤标志物从肿瘤自身蛋白层面的分析，增加了肿瘤早期筛查的准确度。

2、转化生长因子α(transforming growth factor alpha，tgf-α)是表皮生长因子家族被鉴定的第二个成员，tgf-α与细胞迁移、生长和分化有关。tgf-α失调会引起各种上皮性癌症，而且还以旁分泌方式调节肿瘤微环境，使肿瘤与周围基质和免疫系统之间产生交叉对话。tgf-α在许多原发性上皮性肿瘤中表达增加，可以作为早期分子学反应(简称emr)的生物标志物之一，用于预测emr和深度分子反应。emr是慢性期慢性骨髓性白血病患者经过伊马替尼/格列卫治疗预后的有力预测因素。

3、转化生长因子β(transforming growth factorβ，tgf-β)是一种多功能细胞因子，在组织纤维化中参与炎症浸润、细胞生长、细胞凋亡和分化等过程。人类具有三种tgf-β亚型：tgf-β1，tgf-β2和tgf-β3。其中tgf-β1发挥强大的抗炎功能，是免疫反应的主调节器。在肿瘤性疾病中，tgf-β抑制早期病变的发展，但是到了后期，癌细胞中的自分泌和旁分泌tgf-β信号会促进其转移，还有助于肿瘤基质的形成、血管生成和免疫抑制。

4、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，g-csf)能够诱导正常粒细胞集落增殖和白血病细胞系成熟，用于骨髓中性粒细胞的成熟和动员。在体内和体外给予g-csf可能会导致细胞因子的产生发生改变，使炎症上行，并直接影响巨噬细胞和t辅助细胞的极化，促进肿瘤的发生。分泌g-csf的肿瘤具有高度的侵略性，并与二次转移、更差的预后和低生存率直接相关。在分泌g-csf的肿瘤内，肿瘤微环境引起的动态变化可以作为早期疾病进展和治疗反应的标志，例如g-csf水平升高被认为是非小细胞肺癌患者生存期缩短的标志。

5、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，gm-csf)最初被认为是一种csf，属于造血细胞因子家族。gm-csf可能对肿瘤的进展和侵袭有直接影响。gm-csf的表达在许多人类癌症中被上调，在大多数这些癌症中，高水平的循环或肿瘤中的gm-csf水平与不良预后相关，例如gm-csf与血小板衍生的生长因子和血管内皮生长因子的表达增加与颈部鳞状细胞癌患者的侵袭和不良预后明显相关；gm-csf及其受体的高水平表达与结直肠癌患者的5年生存率提高有关。gm-csf通过免疫或非免疫机制作用于不同类型和发展阶段的肿瘤。

6、cxc趋化因子配体12(chemokine(c-x-c motif)ligand 12，cxcl12)，也被称为基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor，sdf-1)，属于趋化因子的cxc亚家族。在癌症中，cxcl12与其受体之间的结合导致不同的途径激活，通过癌细胞、迁移、血管生成和上皮向间质转化，参与肿瘤的发生和发展。cxcl12在肿瘤细胞与周围微环境的交流中起着重要作用。cxcl12和其受体的相互作用随后激发了下游的信号通路，影响了肿瘤的血管生成、肿瘤细胞的增殖和化疗抗性，因此是一个潜在的癌症治疗目标。测定cxcl12的表达有可能作为一种癌症生物标志物，并增加各种癌症类型的预后信息。

7、血管内皮生长因子-a(vascular endothelial growth factor，vegf-a)通常被为vegf，是vegf家族最重要、被研究最深入的成员。vegf-a是一种二聚体糖蛋白，具有两种主要的生物学活性：刺激血管内皮细胞增殖和增加血管通透性。肿瘤细胞的自分泌和旁分泌的vegf信号起到促进肿瘤发生的关键作用，包括癌症干细胞的自我更新和生存，而不依赖于血管生成。vegf的表达已被证明与瘤内tregs呈正相关，是各种恶性肿瘤不良后果的预后标志。

8、肿瘤的形成与机体免疫系统息息相关，肿瘤伴随诊断因子是肿瘤相关细胞因子，常由免疫细胞产生，综上所述，以上各因子均不同程度的参与了肿瘤的发生发展过程，可通过肿瘤伴随诊断因子的联合检测从免疫系统进行监测。

9、现有专利202210977129.2公开了一种悬浮芯片系统及其应用以及基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子检测方法，能够对tgf-α，tgf-β1，cxcl12，vegf，gm-csf，g-csf此六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测，但是，上述检测也存在亟待解决的问题：其方法局限性高，仅适用于悬浮芯片系统；操作繁琐，需要配备其一整套检测仪器和磁性微球试剂，检测成本高，难以普及；而且其检测范围窄，tgf-α：8.75–560pg/ml、tgf-β1：31.3–1000pg/ml、cxcl12：7.9–1018pg/ml、vegf：23.4–1497.6pg/ml、gm-csf：9.0–580pg/ml、g-csf：31.2–2000pg/ml；由于该检测方法中没有试剂对非特异性结合进行阻断，在实际使用中会存在假阳性的问题。

10、因此，有必要提供一种新型的试剂盒及其检测方法以解决现有技术中存在的上述问题。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其检测方法，能够对tgf-α，tgf-β1，cxcl12，vegf，gm-csf，g-csf此六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测，能够在常规的流式细胞仪下实现同时检测，操作简洁、检测方便且成本低，且保持较高的灵敏度，不存在假阳性问题。

2、本发明为避免在上述六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测时发生假阳性，经过大量试验研究，找到了一种阻断剂溶液，使用兔igg对患者样本中潜在的人抗兔抗体进行阻断，并用鼠igg和hama阻断剂进行组合，极大改善了阻断效果，保持较高的灵敏度，不存在假阳性问题。

3、本发明为提高在上述六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测的过程中孵育的效果，经过大量试验研究，找到了一种孵育剂，乙二胺四乙酸二钠和透明质酸钠，能够显著降低检出限，其二者的组合能够协同作用、进一步降低检出限。透明质酸钠具有显著的增稠效果，能够提高体系的粘稠度以抑制微球沉降，促进微球分散；乙二胺四乙酸二钠能够提供络合效果，保持分散的体系结构的稳定，又能提供一定的流动性，促进孵育中反应的进行，提高灵敏度。

4、本发明检测过程中出现过基质效应，即基质对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。为消除这一基质效应，本发明经过大量试验研究，找到了一种基质，含有20％小鼠血清，能够避免基质对分析物的测定发生干扰，控制回收率在100±15％以内，增强检测过程的稳定性和特异性。

5、本发明对微球的标记抗体类型进行了筛选，发现使用兔抗标记(偶联微球的抗体为兔单克隆抗体)的微球具有更强的特异性和更高的检测灵敏度。更换兔抗后，tgf-α，tgf-β1，cxcl12，vegf，gm-csf，g-csf的检出限降低，检测灵敏度明显提高。上述结果可能的原因在于：兔抗能够识别人类抗原上在啮齿动物中没有免疫原性的表位，增加了可靶向表位的总数；兔抗对小分子和半抗原有强烈的免疫反应，这在啮齿类动物中并不常见；近交品系的家兔更为稀少，而大多数小鼠品系是近交系，因此家兔具有更多的免疫反应多样性；家兔使用独特的机制来遗传产生和多样化抗体，使其具有高亲和力和特异性。

6、抗体fc片段是抗体的恒定区，在这个恒定区域内氨基酸的序列在不同的抗体中呈现相同的状态，抗体的不同类型，由抗体fc片段的特异性结构来进一步决定。抗体fc片段发生结构性改变是在免疫球蛋白与抗原结合以后，其会有各种生物效应产生，抗原与抗体的复合物通过fc受体，从而对细胞产生一定介导作用，在免疫功能中起着比较大的作用。

7、本发明通过大量试验研究，发现在本发明的检测过程中，非特异性干扰会对检测产生较大影响。本发明在研究过程中，将非特异性样本稀释后测试，其测试浓度与原液测试浓度的比例明显不同于稀释倍数。使用同型对照抗体测试非特异性样本，其测试浓度明显高于本底，这表明非特异性反应主要由抗体的fc片段引起，也表明干扰主要源于异嗜性抗体(ha)的干扰。

8、本发明仅对偶联生物素的抗人tgf-α抗体、抗人tgf-β1抗体、抗人cxcl12抗体、抗人vegf抗体去除fc片段；不对抗人gm-csf抗体、抗人g-csf抗体去除fc片段。不对抗人gm-csf抗体、抗人g-csf抗体去除fc片段的原因在于去除fc片段会导致抗人gm-csf抗体、抗人g-csf抗体的蛋白构型发生变化，反而降低了gm-csf抗体、抗人g-csf抗体的特异性，降低了灵敏度。

9、一方面，本发明提供了一种用于检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒，所述试剂盒包括偶联抗体的微球混合液、生物素偶联抗体溶液、阻断剂溶液；所述阻断剂溶液包括兔igg、鼠igg、hama阻断剂；所述抗体为抗人tgf-α抗体、抗人tgf-β1抗体、抗人cxcl12抗体、抗人vegf抗体、抗人gm-csf抗体、抗人g-csf抗体中的一种或多种。

10、进一步的，所述试剂盒还包括孵育剂，所述孵育剂包括乙二胺四乙酸二钠、透明质酸钠。

11、进一步的，所述试剂盒还包括基质溶液，所述基质溶液包括牛血清白蛋白、小鼠血清、甘氨酸；所述小鼠血清为无内源检测靶点的小鼠血清，所述小鼠血清的体积百分数为20％。

12、进一步的，所述偶联微球的抗体为兔单克隆抗体。

13、进一步的，所述偶联生物素的抗人tgf-α抗体、抗人tgf-β1抗体、抗人cxcl12抗体、抗人vegf抗体去除fc片段。

14、进一步的，还包括荧光试剂，所述荧光试剂为生物素-bsa-sa-pe，所述生物素-bsa-sa-pe为与生物素-bsa交联的链霉亲和素与藻红蛋白偶联物。

15、进一步的，还包括校准品、质控品，所述校准品、质控品由所述基质溶液配制为对应的校准品溶液、质控品溶液。

16、进一步的，还包括样品稀释液、洗涤缓冲液，所述样品稀释液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白、tween20、proclin300；所述洗涤缓冲液包括pbs缓冲液、牛血清白蛋白、tween20、proclin300。

17、另一方面，本发明还提供了上述试剂盒的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

18、s1：向样本管中依次加入所述阻断剂溶液、偶联抗体的微球混合液和待测样本；

19、s2：向所述步骤s1所得混合物中加入生物素偶联抗体溶液、孵育剂，将得到的混合物在室温下避光震荡孵育；

20、s3：向所述步骤s2所得混合物中加入荧光试剂，将得到的混合物在室温下避光孵育，得到第一复合物；

21、s4：在流式细胞仪上检测所述第一复合物的荧光类型和荧光信号强度，计算得到所述待测样品中所述tgf-α、tgf-β1、cxcl12、vegf、gm-csf、g-csf的含量。

22、另一方面，本发明还提供了一种阻断剂溶液用于制备促进阻断非特异性结合的制剂的用途，所述阻断剂溶液包括兔igg、鼠igg、hama阻断剂。

23、本发明取得的有益效果：

24、1、本发明试剂盒使用双抗体夹心检测方法，选取tgf-α，tgf-β1，cxcl12，vegf，gm-csf，g-csf此六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测，能够在同一样品中同时完成上述肿瘤伴随诊断因子的检测，提高了肿瘤伴随诊断因子检测的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，而且特异性强、灵敏度高、重复性好，具有较好的应用前景。

25、2、本发明创新性地在tgf-α，tgf-β1，cxcl12，vegf，gm-csf，g-csf此六种不同的肿瘤伴随诊断因子的检测试剂盒中加入阻断剂溶液，阻断剂溶液包括兔igg、鼠igg、hama阻断剂，能够针对性地阻断非特异性结合的发生，消除检测发生假阳性的问题，提高检测灵敏度，扩大检测范围：tgf-α检测范围6.10–25000pg/ml、tgf-β1检测范围9.77–20000pg/ml、cxcl12检测范围9.16–75000pg/ml、vegf检测范围12.21–50000pg/ml、gm-csf检测范围4.88–5000pg/ml、g-csf检测范围12.21–50000pg/ml。

26、3、本发明对微球的孵育过程进行了探索研究，发现在孵育过程中添加孵育剂能使微球在一定程度保持悬浮而不沉降，减少微球团聚的发生；孵育剂包括乙二胺四乙酸二钠、透明质酸钠，相互协同作用保持微球的长效悬浮效果，促进孵育过程的反应进行，以此改善检测效果，提高检测灵敏度。

27、4、本发明提供了一种能够避免基质效应的基质溶液，含有20％小鼠血清，能够控制回收率在100±15％以内，增强检测过程的稳定性和特异性。

28、5、本发明去除偶联生物素的抗体的fc段，排除了非特异性反应的干扰，提高检测结果的准确性与灵敏度。