鉴定或评估有益活性物质的方法以及包含其的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明一般来讲涉及鉴定或评估用于个人护理组合物中的有益活性成分的方法。 更具体地，本发明涉及鉴定或评估抵抗氧化应激反应对皮肤细胞的效应的活性物质的方 法。
【背景技术】
[0002] 生命的根本性基础是生物体产生能量的需求和能力。在人类中，食物被摄入并转 化为化合物诸如三磷酸腺苷（"ATP"）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（"NAD"），它们存储被身 体的细胞用于进行维持生命的生物学过程的能量。将食物的有用组分（例如，碳水化合物、 脂肪和蛋白质）转化为可用的能量的细胞代谢途径是复杂的，并且可以尚未被全面地理解 的方式被多种因素影响。哺乳动物的皮肤细胞也不例外。皮肤细胞已知包括以动态的、复杂 的关系共同起作用，以维持皮肤的健康状态的多种不同类型的细胞。例如，角质细胞增殖和 分化，以提供皮肤的连续代谢周转。已知黑素细胞提供用于皮肤色素沉积的黑素合成。而 成纤维细胞已知合成细胞外基质和胶原，其帮助维持皮肤的厚度和弹性。相似地，存在于皮 肤或其他身体器官内或周围的其他细胞，诸如肌细胞、干细胞、皮脂腺细胞、神经细胞、和脂 肪细胞，均需要来源于能够被多种不同因素不利地影响的复杂代谢途径的能量。
[0003] 各种紧张性刺激对细胞的生物能量学的影响和对细胞老化、以及其他疾病（例 如，癌症、神经退行性疾病、糖尿病、和心血管疾病）的影响的了解越来越多。代谢的改变在 疾病状态中的一些这些效应背后的一种理论是老化的自由基理论。即，哺乳动物细胞暴露 于反应性氧物质（"ROS"）导致细胞结构和细胞器（诸如线粒体）的损伤。ROS是包含氧的 高度反应性的分子（例如，氧离子和过氧化物）。ROS作为氧的正常代谢的天然副产物在细 胞内形成，并在细胞信号转导和体内平衡中发挥作用。然而，当细胞暴露于紧张性刺激（诸 如热或紫外线辐射）时，ROS水平能够升高，并且在一些情况下显著地升高。
[0004] 由于ROS导致的损伤随着时间积累，其在细胞水平导致越来越多的氧化应激反 应，这最终可导致组织的损伤和/或器官功能障碍。氧化应激反应对细胞的一种效应是细 胞的生物能量学能力的减弱，这能够导致降低的ATP和/或NAD水平。这对于人类皮肤而言 可能是尤其成问题的，因为在人类皮肤细胞上的氧化应激反应可显示为老化的可见信号。 另外，诸如紫外线辐射（"UV"）和污染物（例如，香烟烟雾、汽车尾气、臭氧）的环境紧张性 刺激能够导致ROS产生水平的升高。随时间推移，这可导致皮肤的结构和形态的显著变化 (例如，"光损伤"），并且在更加极端的程度，导致皮肤癌。
[0005] 人类皮肤细胞通过利用诸如谷胱甘肽和NAD的氧化还原调节剂以及能够中和ROS 的各种酶来抵御R0S。然而，这些防御能够被紧张性刺激诱导的ROS的高峰击败，导致能量 稳态和代谢效率的急性的以及慢性的改变，总体上导致细胞的功能障碍。使情况复杂的是， 与人类皮肤相关联的细胞类型的多样性和这些细胞的代谢途径的复杂性，使得难以鉴定适 合的化合物来帮助抵抗与暴露于特定的氧化紧张性刺激或紧张性刺激的组合相关联的抗 衰老效应。某些氧化紧张性刺激不同地影响不同类型的细胞和/或代谢途径。这使得难以 选择抵抗特定的一种或多种紧张性刺激的不期望效应的合适的护肤活性物质或活性物质 的组合（其效应也可根据细胞或代谢途径的类型而变化）。由于至少一些消费者希望得到 抵抗与氧化应激反应相关联的不期望的老化效应的护肤组合物，因此存在对鉴定合适的护 肤化合物的方法的需求，所述护肤化合物能够被用于制备护肤组合物，以帮助减少、防止和 /或逆转与各种紧张性刺激（尤其是通常的环境紧张性刺激）相关联的不期望的氧化应激 反应。
[0006] 作为发现抵抗氧化应激反应的代谢效应的合适的护肤活性物质的初始步骤，必须 找到能够检测由紧张性刺激和活性物质导致的细胞代谢变化的方法。用于评估细胞的产能 过程的多种方法是已知的。例如，Clark型电极探针用于测量氧气消耗是已知的。Clark电 极提供动力学信息（即，响应的速率），但其连续的氧气消耗引入了伪迹（即，影响测试结果 的一些不期望的和/或外部的因子），呈现了测量腔室中对细胞或分离的线粒体的氧气压 力的降低。尽管氧气消耗可提供线粒体功能的指示，其仅测量了细胞的生物能学的一部分， 并且没有提供对有助于生物能学平衡的其他代谢途径（即糖酵解）的评估。
[0007] 用于评估细胞的产能的另一个常规方法是通过测量细胞中ATP的量。用于对总的 能量代谢定量的发光ATP检测试剂盒是可商购获得的。ATP测定已知是相对灵敏的，但它 们可能不是线粒体功能的理想度量，因为细胞尽力维持特定的ATP预算并将相应地调整代 谢。因此，ATP水平的改变通常仅在病理生理改变期间可检测。此外，ATP测定是破坏性的 (即，为了测量ATP的量，细胞被破坏）并且它们缺少动力学信息。另外，来自垂死或死亡细 胞中存在的残余ATP的伪迹已被报道。并且类似Clark电极测定，ATP不能确定不同的代 谢途径对总的ATP产量的相对贡献。
[0008] 另一种用于评估细胞能量学的常规方法是使用可商购获得的MTT/XTT或 alamarBlue?试剂盒。虽然这些试剂盒可提供评估细胞健康状态的相对简单的方式，但它 们不像ATP测定那样灵敏。此外，它们还被报道通过细胞毒性引入误差，而这正好是它们预 期要测量的参数。另外，两种测定均为破坏性的，并且不提供动力学信息。
[0009] 因此，希望提供鉴定和/或评估减少、防止和/或逆转在特定类型的皮肤细胞上与 特定紧张性刺激相关联的不期望的氧化应激反应的活性物质的方法。也希望提供包括通过 上述方法鉴定的护肤活性物质的护肤组合物。还希望提供处理被来自特定紧张性刺激的在 特定类型的皮肤细胞上的氧化应激反应损伤的皮肤的方法。
【附图说明】
[0010] 图1A、IB和IC示出了角质细胞的氧气消耗速率。
[0011] 图2示出了角质细胞的氧气消耗速率。
[0012] 图3A、3B和3C示出了角质细胞的细胞外酸化速率。
[0013] 图4示出了角质细胞的细胞外酸化速率。
[0014] 图5A、5B、5C、ro和5E示出了成纤维细胞的氧气消耗速率。
[0015] 图6示出了成纤维细胞的氧气消耗速率。
[0016] 图7A、7B、7C、7D和7E示出了成纤维细胞的细胞外酸化速率。
[0017] 图8示出了成纤维细胞的细胞外酸化速率。
[0018] 图9示出了成纤维细胞的细胞外酸化速率。
[0019] 图10示出了成纤维细胞的细胞外酸化速率。
[0020] 图11示出了成纤维细胞的氧气消耗速率。
【发明内容】
[0021] 为了提供对前述问题的解决方法，本文公开了鉴定或评估改善皮肤细胞（诸如角 质细胞和成纤维细胞）的代谢的护肤活性物质的方法。所述方法涉及使皮肤细胞暴露于紧 张性刺激和受试试剂，并基于与糖酵解和氧化磷酸化相关联的代谢指标的变化，测定对所 述受试试剂的响应。当氧化磷酸化和/或糖酵解响应对应于细胞的代谢的改善时，所述受 试试剂可被鉴定为护肤活性物质。
[0022] 本文还公开了一种制备提供皮肤健康有益效果并适用于局部施用至皮肤的个人 护理组合物的方法，所述方法包括：根据本文所公开的方法鉴定活性物质；以及将安全且 有效量的所述活性物质掺入药学上可接受的载体中。
[0023] 本文还公开了改善皮肤健康状态的方法，所述方法包括：鉴定需要护肤有益效果 的目标皮肤区域；以及将美容上有效量的根据本文所公开的方法制备的个人护理组合物施 用至所述目标区域。
[0024] 本发明还公开了鉴定改善成纤维细胞的代谢的皮肤有益剂的方法，所述方法包 括：提供多个成纤维细胞；使成纤维细胞暴露于紧张性刺激；非致死地检测与糖酵解代谢 途径和氧化磷酸化代谢途径各自相关联的代谢指标，以提供每一代谢途径对所述紧张性刺 激的响应；使多个成纤维细胞暴露于受试试剂；非致死地检测与糖酵解和氧化磷酸化代谢 途径各自相关联的代谢指标，以提供每一代谢途径对所述受试试剂的响应；以及当所述响 应中的至少一个对应于相对于相同代谢途径的成纤维细胞代谢中的改善时，将所述受试试 剂鉴定为皮肤有益剂。
【具体实施方式】
[0025] 除非另外指明，所有百分比均按个人护理组合物的重量计。除非另外特别说明，所 有的比率均为重量比。所有数值范围是包括端值在内的较窄的范围；描述的范围上限和下 限是可互换的，以形成没有明确描述的其它范围。有效数位的数字既不限制所指示的量也 不限制测量精度。所有测量均被理解为是在约25°C和环境条件下进行的，其中"环境条件" 是指在约一个大气压和约50%相对湿度下的条件。
[0026] 定义。
[0027] "美容的"是指在人体的区域提供所期望的视觉效果。视觉美容效果可以是临时性 的、半持久的、或持久的。"化妆品"的一些非限制性示例包括在面部留下颜色的产品，诸如 粉底、睫毛膏、遮瑕膏、眼线膏、眉彩、眼影、腮红、唇膏、唇香膏、化妆底粉、固体乳液粉盒等。
[0028] "皮肤病学可接受的"是指所述组合物或其被如此描述的组分适用于与人的皮肤 接触，而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答等。
[0029] "不同类型的细胞"是指在它们预期的生物性功能方面彼此不同的细胞。相对于彼 此，不同类型的细胞的示例包括但不限于：成纤维细胞、角质细胞、黑素细胞、肌细胞、皮脂 腺细胞、和脂肪细胞。
[0030] "设置"意思是一个元件相对于另一个元件被定位在特定位置。
[0031] "非致死"是指不旨在杀死或破坏被测试或观察的细胞的测试程序。例如，非致死 地检测代谢指标是指在检测后至少75%的细胞是活的（例如，80%、85 %、90 %、95%或甚 至多至99%或更多的细胞保持是活的）。理想的是，100%的细胞在非致死测试后是活的， 但应当理解，一些细胞的死亡或破坏可能是不可避免的和/或与测试无关的。
[0032] "氧化紧张性刺激"是指导致不期望的反应性氧物质在细胞中形成的环境因素。氧 化紧张性刺激的一些非限制性示例包括紫外线辐射、香烟烟雾、臭氧、发动机尾气、柴油机 尾气、烟雾、表面活性剂、和来自计算机监视器或电视机的辐射。
[0033] "个人护理组合物"是指适用于局部施用在哺乳动物皮肤上的组合物。本发明的个 人护理组合物可被用于护肤、美容、和护发产品中；其非限制性用途包括止汗剂、除臭剂、洗 剂（如洗手液和爽身水）、护肤产品（如面部和颈部洗剂、精华液、喷剂）、仿晒美黑剂、化妆 品（如粉底、遮瑕物、胭脂、唇膏、唇彩）、脱毛剂、洗发剂、调理洗发剂、毛发调理剂、毛发染 料、沐浴剂、保湿沐浴剂、沐浴凝胶、洁肤剂、清洁乳、毛发和身体清洁剂、沐浴保湿剂、宠物 洗发剂、剃刮准备剂、须后水、剃刀保湿/润滑条、剃刀剃刮凝胶棒、条阜、清洁用品、女性护 理产品、口腔护理产品和婴儿护理产品。使用任何上述组合物的方法也包括在个人护理组 合物的含义之内。
[0034] "调节皮肤状况"是指使皮肤的外观和/或感觉维持为外观和/或感觉没有或很少 有劣化。
[0035] "安全有效量"是指一定量的化合物或组合物，所述量足以显著引起积极的有益 效果，优选积极的皮肤或感觉有益效果，以独立或组合的形式包括本文所公开的有益效果， 但所述量又足够低以避免严重的副作用，即在技术人员合理判断的范围内提供适当的效险 比。
[0036] "皮肤"是指哺乳