一种检测环孢霉素a浓度的免疫分析方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检测领域，具体地，是一种检测环孢霉素A浓度的免疫分析方法 和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 环孢霉素A(CyclosporineA，CsA)是一种由11个氨基酸组成的亲脂性环状化合 物，其作为一种高效的免疫抑制剂，被广泛应用于抑制器官移植病人的免疫排斥反应，也常 用于治疗牛皮癣、遗传性皮炎、坏疽性脓皮病、荨麻瘆、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。
[0003] 自80年代初期CsA应用于临床以来，CsA在移植排异治疗中发挥了重大作用，在 全球范围内推动了器官移植术的发展。尽管CsA的使用往往伴有多种不良反应，至今全球 仍有数十万例患者使用CsA抑制移植后的排异反应。
[0004] 由于不同患者对CsA的吸收和代谢往往表现出很大的个体差异（Hamwi A,SalomonA,SteinbruggerR,etal,CyclosporineMetabolisminPatientsAfter Kidney,BoneMarrow,Heart-Lung,andLiverTransplantationintheEarlyandLate PosttransplantPeriods,AmJClinPathol. ,2000;114:536-543)，即使使用相同的药物 剂量，不同患者的CsA血药浓度也常差异显著；由于CsA的肝、肾毒性及其狭窄的治疗剂量 范围，CsA的药效与药毒均与血药浓度密切相关，因此，准确检测CsA的血药浓度对于控制 CsA的药毒性和发挥CsA的抗排斥作用均具有重要参考价值。
[0005] 目前，检测CsA血药浓度的方法主要有高压液相色谱法（HPLC)和多种免疫检测 方法（王燕，卜雯婷，李鹏飞，等；常用免疫抑制剂人血中定量监测方法研宄进展，中国临 床药理学与治疗学，2011，16:830-836)，如：放射免疫分析法、微粒子化学发光法、荧光偏振 法、酶联免疫分析法和酶放大免疫分析法。HPLC法能准确检测CsA原药和多种CsA代谢产 物的浓度，但由于CsA紫外吸收微弱，通常需要萃取以浓缩血药，操作繁琐，不宜用于常规 的临床检测，因此免疫检测是目前临床常用的检测方法。
[0006] CsA的免疫检测可使用抗CsA多克隆抗体和单克隆抗体。抗CsA多克隆抗体不可 避免地存在与多种CsA代谢物较大程度的交叉反应，使用多克隆抗体的免疫分析方法检测 的是CsA原药及其多种CsA代谢物的浓度。血液中不同CsA代谢物的免疫抑制活性差别很 大，往往显著低于CsA原药，因此基于多克隆抗体的免疫分析方法检测的血药浓度与CsA药 效的相关性不够明确，而只有使用更特异的抗CsA单克隆抗体才可望将CsA代谢物的交叉 反应降至低水平；因此，抗CsA单克隆抗体是建立CsA检测方法的首选。
[0007] 为获得临床检测所需要的抗CsA单克隆抗体，国内外多个研宄机构和高校 在CsA免疫原合成、抗体制备上做了大量工作（戴晓雁，黄文才，刘一超；环孢菌素 A免疫抗原合成进展，精细化工，2000, 17, 441-444;PapricaP.A,MargaritisA.and PetersenN. 0preparationofNovelCyclosporinADerivatives,Bioconjugate Chem. 1992, 3, 32-36)，但这些工作多停留上免疫原或CsA衍生物合成的层面上，没有获得 能满足CsA临床检测要求的单克隆抗体，其中亲合性不足是抗CsA抗体研制的主要障碍，其 原因主要是含有CsA的免疫原对免疫动物T淋巴细胞功能强烈的抑制作用，该作用减弱了T淋巴细胞对B淋巴细胞的抗原呈递作用，降低了T淋巴细胞分泌淋巴因子的能力，从而抑 制了免疫动物的体液免疫功能，降低了其B细胞产生高亲合性抗体的能力；因此，尽管CsA 的血药浓度通常在200ng/ml-400ng/ml的较高水平，对于缺少高亲合性抗CsA抗体的试剂 研发工作者来说，建立足够灵敏的CsA检测方法仍然是一个严峻的挑战。
【发明内容】
[0008] 本申请的发明人在对建立CsA检测方法的长期研宄中意外发现，以结构与CsA有 微小区别的环孢霉素C(CsC)作为竞争分子建立CsA的免疫检测方法，可以显著地改善CsA 的分析灵敏度，从而可以使用亲合性较低的抗CsA单克隆抗体实现灵敏的CsA检测。
[0009] 因此，本发明的第一个目的在于建立一种灵敏的全血CsA检测方法，其特点是以 CsC为竞争分子，可以使用亲合性较低的抗CsA单克隆抗体实现灵敏的CsA检测。
[0010] 本发明的第二个目的在于提供一种检测CsA浓度的免疫分析试剂盒。
[0011] 为了实现上述技术目的，本发明采用了如下的技术方案：
[0012] 根据本发明的第一个方面，一种检测环孢霉素A浓度的免疫分析方法，采用环孢 霉素C为竞争分子定量检测样品中的环孢霉素A浓度。
[0013] 根据本发明，所述方法包括以下步骤：
[0014] A)制备环孢霉素A-蛋白免疫原；
[0015] B)合成环孢霉素C-蛋白复合物，将其包被微孔，使微孔表面带有环孢霉素C分 子；
[0016] C)标记抗环孢霉素A单克隆抗体；
[0017] D)以微孔表面的环孢霉素C-蛋白复合物为竞争分子，以标记的抗环孢霉素A单克 隆抗体为检测试剂，通过竞争免疫分析定量检测样品中环孢霉素A浓度。
[0018] 根据本发明，所述步骤A)中所述的环孢霉素A-蛋白免疫原的制备包括以下步 骤：
[0019] A)通过光化学反应使环孢霉素A与4-苯甲酰苯甲酸连接，从而在环孢霉素A分子 上引入幾基；
[0020] B)以EDCI或EDCI-NHS活化环孢霉素A分子上引入的羧基；
[0021] C)将活化后的环孢霉素A与蛋白载体偶联，获得环孢霉素A-蛋白免疫原。
[0022] 根据本发明，所述的蛋白载体选自：各种动物来源的血清白蛋白、血清Y-球蛋 白、甲状腺球蛋白，卵清蛋白、或钥孔血蓝蛋白。
[0023] 根据本发明，所述步骤C)中所述的环孢霉素C-蛋白复合物的合成包括以下步 骤：
[0024] A)将丁二酸酐与环孢霉素C反应，使环孢霉素C羧基化；
[0025] B)通过EDCI或EDCI-NHS将羧基化的环孢霉素C与载体蛋白交联。
[0026] 根据本发明，所述步骤D)中所述标记抗环孢霉素A单克隆抗体的标记物选自：酶、 放射性同位素、荧光物质、化学发光物质或稀土离子。
[0027] 根据本发明的优选实施例，所述标记物为Eu3+离子。
[0028] 根据本发明，所述通过竞争免疫分析定量检测样品中环孢霉素A浓度包括以下步 骤：
[0029]A)使用样品前处理试剂处理样品；
[0030]B)在包被有环孢霉素C-蛋白的微孔内加入上述处理后的环孢霉素A校准品或样 品，以及标记的抗环孢霉素A单克隆抗体，形成免疫复合物；
[0031] C)洗涤除去未结合的标记的抗环孢霉素A单克隆抗体，检测微孔表面免疫复合物 中标记的抗环孢霉素A单克隆抗体产生的信号；
[0032] D)根据上述步骤获得的校准曲线和各样品信号强度，对样品中环孢霉素A进行定 量。
[0033] 根据本发明，所述的样品前处理试剂包括全血溶解剂和全血沉降剂。
[0034] 根据本发明的第二个方面，一种检测环孢霉素A浓度的免疫分析试剂盒，所述试 剂盒包括：包被有环孢霉素C-蛋白复合物的固相微孔板，铕离子标记的抗环孢霉素A单克 隆抗体，环孢霉素A校准品，洗涤液，分析缓冲液，荧光增强液，样品前处理试剂。
[0035] 根据本发明，所述的样品前处理试剂包括全血溶解剂和全血沉降剂。
[0036] 根据本发明，所述全血溶解剂选自：皂素、吐温、Triton、SDS等表面活性剂中一种 或几种的组合，或尿素、盐酸胍、蛋白水解酶等蛋白变性剂中一种或几种的组合，所述全血 沉降剂选自：二价金属离子的甲