醇-乙二醇混合溶液，或二价金属离子的DMSO-乙二醇混合 溶液，或二价金属离子-乙二醇混合溶液。
[0037] 根据本发明的优选实施例，所述全血溶解剂含0. 5% -2% (w/v)的皂素，所述全血 沉降剂含IOmM-IOOmM硫酸锌，70%-90% (v/v)甲醇，10%-30% (v/v)乙二醇。
[0038] 本发明的有益效果如下：
[0039] 1)以CsC作为竞争分子建立CsA的免疫检测方法，由于抗CsA单克隆抗体结合CsC 的亲合性弱于CsA，样品中微量的CsA便可有效抑制抗体与CsC的结合，使CsA的检测灵敏 度得以显著改善；
[0040] 2)基于本发明所述方法可显著改善CsA的检测灵敏度，因此可以使用亲合性较低 的抗体建立检测方法，这对于难以获得高亲合力抗体的免疫抑制剂的检测，具有很高的实 用价值；
[0041] 3)本发明所述方法以CsC作为竞争分子建立CsA的免疫分析方法，可以利用CsC 环状结构支链上的活泼羟基，通过丁二酸酐法简单、有效地使其羧基化，反应产物结构单 一，转化率高，使CsC-蛋白复合物的制备变得简单、可控；而传统的CsA羧基化方法需要在 强烈的光化学反应条件下才能完成，且反应产物成份复杂。
【附图说明】
[0042] 图1为环孢霉素A(CsA)结构式。
[0043] 图2为环孢霉素C(CsC)结构式。
[0044] 图3为羧基化后的环孢霉素C的LC-MS质谱图。
[0045] 图4为羧基化后的环孢霉素A的LC-MS质谱图。
[0046] 图5为基于CsC-BSA、CsA-BSA包被的CsA-TRFIA校准曲线及其精密度图。
[0047] 图6为以CsC为竞争分子的CsA-TRFIA与ABBOTTCsA-CMIA试剂测量47份临床 标本的相关性图。
[0048] 图7为以CsA为竞争分子的CsA-TRFIA与ABBOTTCsA-CMIA试剂测量47份临床 标本的相关性图。
【具体实施方式】
[0049] 本发明涉及的缩略词说明：
[0050] CsC:环孢霉素C;
[0051] CsA:环孢霉素A;
[0052] IgG:y_ 球蛋白；
[0053] BSA:牛血清白蛋白；
[0054] KLH:钥孔血蓝蛋白；
[0055] CsC-BSA:环孢霉素C-BSA复合物；
[0056] CsA-BSA:环孢霉素A-BSA复合物；
[0057] DMF:N，N二甲基甲酰胺；
[0058] EDCI:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（l-Ethyl-3-(3-dimethyl laminopropyl)carbodiimidehydrochloride)；
[0059] NHS:N_ 羟基瑭泊酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide);
[0060] MES:2_(N-吗啡啉）乙横酸（2-Morpholinoethanesulfonicacid);
[0061] Sulfo-NHS:N_ 羟基硫代瑭泊酰亚胺（N-Hydroxysulfosuccinimide);
[0062] TSA缓冲液：50mMTris-HCl(pH7. 60)，含 0? 9%NaCl，0. 05%NaN3 ;
[0063] PBS:磷酸盐缓冲液；
[0064] TRFIA:时间分辨焚光免疫测定（Time-resolvedfluorescenceimmunoassay);
[0065] DTPAA-Eu:二乙三胺五乙酸双环酐-铕（Diethylenetriaminepentaaceticacid dianhydride-Eu3+)；
[0066] BBa:4_ 苯甲醜苯甲酸（4-Benzoylbenzoicacid);
[0067] NaN3:叠氮化钠，一种防腐剂。
[0068] 本发明涉及的术语说明：
[0069] 所述的免疫原指能刺激机体免疫细胞产生免疫应答的物质。
[0070] 所述的CsA为小分子，其本身不具有免疫原性，但其与蛋白质复合后可获得刺激 机体产生抗CsA抗体的能力，具有免疫原性。
[0071] 所述的CsC是一种CsA的结构类似物，其与CsA在结构上的主要差别在于CsC的 氨基酸环状结构支链上带有一个羟基（-0H)(图1和图2)，这种微小的结构差别使CsC与抗 CsA单克隆抗体的亲合力显著低于CsA与抗CsA单克隆抗体的亲合力。
[0072] 所述的CsC-蛋白复合物指通过化学方法使CsC与蛋白质偶联制得的复合物；本发 明中，制备该复合物的目的是通过蛋白质对微孔表面的吸附实现CsC在微孔表面的固定。
[0073] 所述的包被，指通过CsC-蛋白复合物对微孔表面的吸附实现CsC在微孔表面固定 的过程。
[0074] 所述的标记抗CsA单克隆抗体，指使用示踪物质与抗CsA单克隆抗体连接的过程； 所述的示踪物质包括但不限于酶、放射性同位素、荧光物质、化学发光物质或稀土离子。
[0075] 所述的竞争免疫分析指样品待测物与固定量的同种或结构类似的待测物共同竞 争结合限量的抗待测物抗体，以实现样品待测物检测的免疫分析方法。
[0076] 本发明所述的采用环孢霉素C作为竞争分子检测环孢霉素A浓度的免疫分析试剂 盒，其主要组份包括环孢霉素C-蛋白复合物包被的微孔板、标记的抗环孢霉素A抗体、样品 前处理试剂、校准品和分析缓冲液。
[0077] 其中，所述的环孢霉素C-蛋白复合物包被的微孔板采用以下方法制备：通过丁二 酸酐法使CsC的侧链羟基羧基化（生成环孢霉素C-半琥珀酸），以EDCI或EDCI-NHS法使 羧基化的CsC与载体蛋白交联。得到的环孢霉素C-蛋白复合物可通过物理吸附法固定于 疏水的微孔表面，也可以通过蛋白所带的多种官能团，如-COOH，-NH2, -OH等，以化学连接 方式结合于其它固相载体（如磁微球）表面。
[0078] 其中，所述的抗环孢霉素A抗体可以是完整的抗体分子或保留完整抗体结合能力 的抗体片段，可以是多克隆抗体或单克隆抗体；为降低交叉反应，优选单克隆抗体。
[0079] 所述环孢霉素A免疫原的制备方法，包括如下步骤：
[0080] A)在300W碘镓灯照射下使CsA的-OH与BBa发生光化学反应，生成带羧基的 CsA-BBa；
[0081] B)以EDCI或EDCI-NHS法将活化的CsA-BBa与载体蛋白偶联，形成具有免疫原性 的CsA-蛋白复合物。
[0082] 其中，所述的样品前处理试剂包括全血溶解剂和全血沉降剂，其作用是溶解血液 细胞，释放蛋白所结合CsA。所述全血溶解剂由表面活性剂组成；所述全血沉降剂由含二 价金属离子的有机溶剂组成，或由尿素、盐酸胍、蛋白水解酶等蛋白变性剂中一种或几种组 成。
[0083] 其中，所述的校准品指含有已知CsA浓度的均质全血溶液，用以对样品CsA浓度 进行定量；以全血为基质配制校准品可以降低校准品与样品二者基质差异（组份、PH、粘度 等）对检测的影响。全血可以是抗凝的人全血或动物全血，经冻融使细胞破裂，成为均质溶 液。
[0084] 其中，所述的分析缓冲液由蛋白质、表面活性剂、防腐剂、抗干扰试剂组成，其作用 在于为免疫反应提供一合适的介质，缓解样品中多种干扰成份（类风湿因子、异嗜性抗体） 对检测的影响。
[0085] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明；应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。
[0086] 以下实施例中，除特别注明外，所涉及的％为质量体积比（w/v)。
[0087] 实施例1包被用CsC-BSA蛋白复合物的制备
[0088] I. 1羧基化环孢霉素C
[0089] 取环孢霉素C35mg溶于Iml二氯甲烷，加入丁二酸酐12mg，4-二甲氨基吡啶 5. 9mg，三乙胺8y1，