用于检测生物样品中αSyn特异性抗体的方法
【专利说明】用于检测生物样品中aSyn特异性抗体的方法
[0001] 本发明涉及用于检测生物样品中α突触核蛋白（aSyn)特异性抗体的方法， 特别是与突触核蛋白病相关，或用于突触核蛋白病的诊断，包括帕金森病（Parkinson's 路易体病（LewyBodyDisease，LBD)，路易体痴呆（DementiawithLewy Bodies，DLB)，帕金森病痴呆（Parkinson'sDiseaseDementia，FOD)，多系统萎缩 (MultipleSystemAtrophy，MSA)，单纯性自主神经衰竭（PureAutonomicFailure，PAF)， REM睡眠行为障碍（REMSle印BehaviorDisorder，RBD)，脑铁沉积型神经退行性病变I型 (NeurodegenerationwithBrainIronAccumulationtypeΙ,ΝΒΙΑTypeI)以及包涵体 肌炎（inclusionbodymyositis，IBM)。本发明进一步涉及用于在生物样品中检测α突触 核蛋白（aSyn)特异性抗体的方法，特别是与α突触核蛋白沉积和/或聚集疾病相关，或 用于这些疾病的诊断，包括阿尔兹海默病（Alzheimer'sdisease，AD)，唐氏综合症（Down Syndrome，DS)，进行性核上性麻瘦（ProgressiveSupranuclearPalsy，PSP)，皮质基底节 变性（CorticobasalDegeneration，CBD)，额颞叶痴呆（FrontotemporalDementia)/匹克 氏病（Pick'sDisease) (FTD/PiD)。
[0002] 突触核蛋白病是神经退行性疾病的一个多元化组，其共有共同的病理特征：在神 经病理学检查中，在选定的神经元和神经胶质细胞群体中，可以检测到含有α突触核蛋白 (aSyn)蛋白异常聚集的特征性病变。
[0003] aSyn(最初鉴定为PARK1和PARK4)是一种140个氨基酸的蛋白，其广泛表达在 新皮质，海马，齿状回，嗅球，纹状体，丘脑和小脑以及外周神经元和神经节中，例如，在结肠 或肌肉组织中。该蛋白的主要形式是140个氨基酸长的转录物。其它亚型为α-突触核蛋 白-98,缺少外显子3和5，α-突触核蛋白-126,其中外显子3缺失并缺少残基41-54 ;以 及α-突触核蛋白-112,其由于外显子5的缺失，缺少残基103-130。aSyn也高表达于造 血细胞中包括B-，T_，和NK细胞以及单核细胞和血小板。在这些细胞中的确切作用未知， 但其涉及巨核细胞（血小板前体）的分化。
[0004] 最常见的突触核蛋白病包括帕金森病（PD)，路易体病（LBD)，路易体痴呆（DLB)， 帕金森病痴呆（PDD)，多系统萎缩（MSA)，单纯性自主神经衰竭（PAF)，REM睡眠行为障碍 (RBD)，脑铁沉积型神经退行性病变I型（NBIATypeI)以及包涵体肌炎（IBM)。
[0005] 目前用于这些疾病的治疗选择包括对症药物例如左旋多巴，多巴胺激动剂，抗胆 碱能药物以及单胺氧化酶的抑制物。然而，目前存在的所有治疗机会仅引起症状的减轻，但 不在患者中诱导持久的疾病改善效果。
[0006] 路易体病（LBD)是进行性神经退行性疾病，其特征为震颤，强直，运动迟缓以及大 脑中多巴胺能神经元的缺失。在DLB和TOD的情况下，征兆还包括认知障碍。西方国家中 高达2%的60岁以上人群形成H)/LBD的典型征兆。目前只有对症治疗可用。不幸的是， 这些疗法仅提供早期症状的暂时减轻，而不阻止疾病进展。对H)/LBD发病机理的理解仍然 不完全，但似乎遗传易感性和环境因素参与该疾病的发展。尽管有所有的遗传进展，PD/LBD 主要是一种没有已知原因的偶发性病患（也称为特发性HVLBD)。
[0007] 患有这种疾病的患者在脑部的皮层区和皮层下区以及外周神经元或神经节例如 结肠神经节形成特有的泛素化的细胞内内含物，称为路易体（LBs)。特别是具有高含量多巴 胺能神经元或神经元投射的区域表现出这种典型的病理特征。最近，几个研究可以表明突 触蛋白aSyn在LBD病理发生中发挥中心作用。在LBD中，aSyn在全部受影响的脑区域 或外周神经元或神经节的LBs积累。另外，可以证明aSyn单个点突变以及基因剂量的改 变（例如，aSyn基因的二倍化或多倍化）与罕见的家族形式的帕金森病相关。重要的是， 基于在转基因（tg)小鼠以及黑腹果蝇中过表达研究的结果，强调了其在H)/LBD病理发生 中的关键作用，因为这些动物模型模拟了HVLBD/DLB的几个特征。
[0008]另外一种非常重要的突触核蛋白病是多系统萎缩（MSA)。MSA是一种偶发性神 经退行性疾病，其特征为左旋多巴抗性帕金森病，小脑共济失调，和自主神经功能异常症 状。患者患有影响多个脑部区域的多系统神经元缺失，包括纹状体，黑质体（substantia nigra)，小脑，脑桥，以及下橄榄体（inferiorolives)和脊髓。MSA特征为在全部中枢神经 系统中，aSyn阳性的神经胶质细胞胞浆（GCI)和罕见的神经元内含物。这些内含物与纹 状体-黑质体退化，橄榄体-脑桥-小脑萎缩，以及延髓和脊髓自主神经核受累相关。GCIs 对于MSA发病机理的重要性通过最近对转基因小鼠模型的分析，分析aSyn在少突胶质细 胞中过表达而通常被公认和强调。在过表达人aSyn的tg小鼠中，观察到了GCI样聚集物 和MSA的生化标志物。
[0009] 虽然aSyn的积累通过哪些具体机制导致突触核蛋白病中的神经退行的典型特 征尚未完全理解，最近的研究暗示，aSyn积累的异常形成参与突触核蛋白病潜在的退化过 程。最近，在LBs中已鉴定了不同形式的aSyn。除了全长形式的蛋白，已鉴定了不同形式 的修饰的aSyn，包括磷酸化的，亚硝基化的/硝化的，乙酰化的和单_，二_，或三泛素化的 aSyn。另外，该蛋白的C端截短形式，如aSynl_119，aSyn1-122和aSyn1-123,已经 在来自转基因小鼠和H)/MSA病理的脑组织中检测到。
[0010] 目前认为在LBs和路易轴突（lewyneurites)或GCI中检测到的15%的aSyn是 截短的。使用截短的aSyn的早先体外研究可以证明，缺少C端20-30个氨基酸的aSyn表 现出增加的聚集和形成路易轴突和LBs中发现的纤维的倾向。另外，大约90%的在LBs中 沉积的aSyn丝氨酸129(Serl29)是磷酸化的。相反，在正常脑中，仅4%的全部aSyn是 磷酸化的，提示Serl29磷酸化的aSyn的累积在Η)的发病机理中可能是至关重要的。因 此，这些截短和/或修饰形式的aSyn被认为对于aSyn寡聚物/纤丝的形成充当种子分 子。因此随后认为全长的aSyn以及截短和/或修饰形式的aSyn累积，其导致聚集形成。 基于最近的研究，认为例如在突出末梢和轴突中这种聚集形成（例如，寡聚物和纤丝），对 于H)/LBD/突触核蛋白病的发展发挥重要作用，并因此可以通过截短/修饰形式的aSyn 的存在而增强。
[0011] 突触核蛋白病，特别是LBD/ro和MSA的诊断，是基于逐步发生的动作迟缓和至 少一个以下失常的纯粹临床诊断：肌肉强直，4-6Hz静止性震颤和/或不是由初级视觉， 前庭，小脑或本体感受障碍引起的姿势不稳定（JankovicJ.等，上如111'〇1.如111'〇811找· Psychiatr. (2008)79(4):368 - 76.标准：UnitedKingdomParkinson'sDisease SocietyBrainBankDiagnosticCriteriaforParkinson,sDiseaseandCriteria ofdiagnosisofParkinsondisease(Gelb等，1999)由神经障碍和中风国立研究院的 咨询委员会，美国国立卫生研究院（AdvisoryCounciloftheNationalInstituteof NeurologicalDisordersandStroke,USNationalInstitutesofHealth)委托和支 持）。PD/LBD另外的诊断主要依赖于另外的支持性临床征兆的实现和排除可以继发性产生 帕金森病综合症，像是阿尔兹海默病，多发性脑梗塞和药物引起的帕金森病的其它原因。还 必须排除帕金森叠加综合症例如进行性核上性麻痹，以及多系统萎缩以建立可能的H)/LBD 诊断。
[0012] 对于MSA，可能的MSA的诊断要求一种偶发的，进行性成人发病病症，包括严 格定义的自主神经衰竭和左旋多巴反应不良性帕金森病或小脑共济失调（Gilman等， Neurology. (2008)Aug26 ；71 (9):670-6.Secondconsensusstatementonthediagnosis ofmultiplesystematrophy)〇
[0013] PD/LBD/MSA的临床诊断的局限性是高误诊率（尸检评价的诊断特异性为 75-90%，其中专家例如神经学家具有最高的比率；如111?)￥；[01]\如111'〇1.如111'〇811找· Psychiatr. (2008)79(4):368 - 76.)，以及诊断在当疾病已经造成了导致功能缺陷的大量 神经元缺失时的很晚的时间点才能完成的事实。
[0014] 除了临床诊断外，最先进的成像技术目前被用于证实突触核蛋白病的诊断。患者 的计算机断层扫描和磁性共振成像（MRI)脑部扫描经常显得正常，但使用分析来排除帕金 森病的其它次要原因，例如基底神经节肿瘤，血管病变和脑积水（BrooksDJ等，J.Nucl. Med. (2010)51⑷：596 - 609)。然而，专业的MRI技术（例如，弥散张量成像（DTI))已经 通过探索基底神经节和中脑结构的改变显示了更一致和有希望的结果。进一步开发了多 巴胺能成像来将多巴胺能神经退行的形式与其它不影响多巴胺能系统的疾病区分（例如， PD/LBD)。该成像可以使用单光子发射计算机断层扫描（SPECT)或PET进行。例如，在具有 退行性帕金森病和非退行性震颤病患之间诊断不确定性的患者中，使用多巴胺转运蛋白配 体[1231]碘氟潘（DaTscan?)的基准成像已经表现出78%的灵敏度和97%的特异性，参照 3年的临床诊断，对于基准临床诊断分别为93%和46%(CummingsJL等，Brain. (2011); 134(11):3146-3166.)。
[0015]目前用于诊断突触核蛋白病的算法苦于缺乏对于疾病早期的安全诊断的灵敏 度和特异性。为了提高诊断能力，临床以及成像数据必须与疾病特异性生物标志物的病 理-生理上有意义的变化联合使用。这种变化如示例于通过结构MRI评估的伴随海马萎 缩的阿尔斯海默病；AD-典型的脑脊液特征（低Αβ42,高总tau蛋白，高磷酸化Tau蛋 白）；阳性淀粉样蛋白成像；确定的遗传风险；如通过国际监管机构和利益集团，包括美国 国家衰老研究所（ΝΙΑ,ΝΙΗ，USA)，NIGNINCDS工作组，以及阿尔兹海默病协会（Alzheimer Association)所建议的，已经作为AD的诊断步骤中根本变化的基础（Dubois等，Lancet Neurol. 9(2010):1118-1127)〇
[0016] 不幸的是，对于HVLBD/MSA，目前没有这种经过验证的标志物数据可用。然而， 在帕金森病MichaelJFox基金会带领下的临床和生物医学研究者的国际联盟最近已经 发起了帕金森病渐进性标记物（PPMI)倡议，一个具有里程碑意义的观察性临床研究，使 用先进的成像，生物取样和临床以及行为评估来综合评价一群最近诊断的ro患者和监控 受试者，以鉴定帕金森病进展的生物标记物。一个主要的目标是评价在不同体液中，作为 突触核蛋白病疾病进展的潜在生物标志物的aSyn水平的变化。这一目标基于aSyn对 于疾病进展潜在的中心作用，以及在不同机体组织和体液中aSyn的鉴定。由Lebouvier 等和Shannon等进行的研究揭示了在Η)患者的外周组织中的aSyn病理学（Lebouvier等，PLoSONE(2010) 5(9):el2728;Shannon等，Mov.Disord. (2012)27:709 - 715)。已经 在突触核蛋白病患者和健康对照的CSF和血衆中鉴定了aSyn(Borghi等，Neuroscience Letters, (2000) 287:1,pp65-67 ；JournalofNeuralTransmission(2006), 113, 10,pp 1435-1439;Lee等，ExperimentalNeurology, (2007) 204:2,pp583 _ 588)。有趣的是，如 Qiao-XinLi等最近的研究，对于健康的和患病的受试者中aSyn水平存在相互矛盾的证 据（ExperimentalNeurology, (2007)204:2，pp583 - 588)，表明在来自PD受试